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Jan 05, 2024

Mikrobiom rehydrierter Mais- und Sorghumkornsilagen, die in verschiedenen Fermentationsperioden mit mikrobiellen Impfmitteln behandelt wurden

Scientific Reports Band 12, Artikelnummer: 16864 (2022) Diesen Artikel zitieren 1331 Zugriffe 5 Zitate 6 Details zu altmetrischen Metriken Aufgrund der gleichzeitig entstandenen komplizierten Beziehungen und der gegenseitigen Beeinflussung

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 16864 (2022) Diesen Artikel zitieren

1331 Zugriffe

5 Zitate

6 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Aufgrund der gleichzeitig entstandenen komplizierten Beziehungen und des gegenseitigen Einflusses zwischen Veränderungen im Mikrobiom und der Qualität der Silagegärung haben wir die Auswirkungen der Impfmittel Lactobacillus plantarum und Propionibacterium acidipropionici (Inoc1) oder Lactobacillus buchneri (Inoc2) auf die Diversität und die Nachfolge der Bakterien- und Pilzgemeinschaft untersucht von rehydrierten Mais- (CG) und Sorghum- (SG) Körnern und deren Silagen mithilfe der Illumina Miseq-Sequenzierung nach 0, 3, 7, 21, 90 und 360 Tagen Fermentation. Die Auswirkungen von Impfmitteln auf die Bakterien- und Pilzsukzession waren je nach Getreide unterschiedlich. Lactobacillus- und Weissella-Arten waren die Hauptbakterien, die an der Fermentation von rehydrierter Mais- und Sorghumkornsilage beteiligt waren. Aspergillus spp. Schimmel war in der rehydrierten CG-Fermentation vorherrschend, während die Hefe Wickerhamomyces anomalus der Hauptpilz in rehydrierten SG-Silagen war. Inoc1 war bei der Förderung des starken Wachstums von Lactobacillus spp. effizienter als CTRL und Inoc2. und Aufrechterhaltung der Stabilität der Bakteriengemeinschaft während langer Lagerungszeiten in beiden Getreidesilagen. Allerdings blieben die Bakterien- und Pilzgemeinschaften rehydrierter Mais- und Sorghumkorn-Silagen nach 360 Tagen Lagerung nicht stabil.

Mais- und Sorghumkörner wurden in Konzentraten verwendet, die Wiederkäuern angeboten wurden, um Energie hauptsächlich aus ihrem Stärkegehalt zu gewinnen1. Das Getreideendosperm enthält den höchsten Anteil an Stärke und bestimmt den wirtschaftlichen und Nährwert des Getreides, da die Struktur und Zusammensetzung der Stärke sowie ihre physikalische Wechselwirkung mit Getreideprotein ihre Verdaulichkeit verändern können2. Die Wirkung des Endosperms auf die Verdaulichkeit kann durch die Getreideverarbeitung manipuliert werden3. Rehydrierte Getreidesilage ist eine vielversprechende Technik zur Verbesserung des Nährwerts von Getreide4, und unter den Getreidearten weist Sorghum nach diesem Prozess den höchsten Zugewinn an Verdaulichkeit auf, gefolgt von Maiskörnern und anderen Getreidearten5.

Während des Siliervorgangs kann die Erhöhung der Verdaulichkeit der Getreidestärke auf einen teilweisen Abbau der hydrophoben Stärke-Protein-Matrix, die die Stärkekörnchen umgibt, durch Proteolyse zurückzuführen sein6, was zu einer stärkeren Solubilisierung von Prolamin und einer größeren Oberfläche der Stärkekörnchen für einen möglichen Angriff durch Pansenbakterien7 führt.

Studien haben gezeigt, dass die klimatischen Bedingungen alle Phasen der Silageproduktion und -verwertung beeinflussen, insbesondere in heißen und feuchten Gebieten, da die mikrobielle Vermehrung stark von der Temperatur beeinflusst wird8. Diese klimatischen Faktoren beeinflussen nicht nur das Wachstum der Futterpflanzen und das Auftreten von Krankheiten, sondern beeinflussen auch die Fermentation der Silage und die aerobe Stabilität9.

Es wurde berichtet, dass Lactobacillus plantarum das am häufigsten verwendete Silierimpfmittel ist10. Diese Art produziert Milchsäure, die den pH-Wert schnell senkt und die Fermentation verbessert11. Es sind jedoch große Mengen an Silage verloren gegangen, und die Produktionskosten können sich aufgrund des aeroben Verfalls negativ auswirken; Daher wurden Propionsäurebakterien und heterofermentative Bakterien, die Acetat produzieren, untersucht, um die Verschlechterung von Silagen nach Einwirkung von Luft zu verringern4,12.

Die bakterielle Inokulation kann die Fermentationseigenschaften und den Nährwert der Silage je nach den im Rohmaterial vorhandenen epiphytischen Bakterien13 und den Stämmen in den verschiedenen Silagematerialien14 unterschiedlich beeinflussen. Laut Si et al.13 haben sich Silage und ihre Mikrobiota in komplizierten Beziehungen gemeinsam entwickelt, und es besteht ein gegenseitiger Einfluss zwischen Veränderungen im Mikrobiom und Fermentationsparametern der Silage, wie z. B. der positiven Korrelation zwischen Lactobacillus plantarum und dem Milchsäuregehalt. Im Allgemeinen unterliegt die Zusammensetzung der Mikroorganismen vor und nach dem Silieren erheblichen Veränderungen15. Die Überwachung dieser Veränderungen während des Silierens wäre hilfreich für ein umfassendes Verständnis und eine Verbesserung des Silierprozesses16.

Kürzlich wurden molekulare Methoden eingesetzt, um die Qualität, Aktivität und Dynamik einer komplexen Gemeinschaft von Mikroorganismen zu bewerten, die an der Futterkonservierung beteiligt sind17,18,19, wodurch eine Unterschätzung der mikrobiellen Vielfalt von Silagen vermieden wurde20. Trotz des Potenzials von rehydrierten Getreidesilagen und der Tatsache, dass silageassoziierte Mikroorganismen die Silagequalität und die Gesundheit von Wiederkäuern erheblich beeinträchtigen können, haben nur wenige Studien die Mikrobenpopulation und ihre Dynamik während des Fermentationsprozesses von rehydrierten Mais- und Sorghumkörnern untersucht, insbesondere bei der Verwendung der nächsten Generation Sequenzierung.

In diesem Zusammenhang haben wir in Erwartung einer raschen Veränderung der Silageumgebung und unterschiedlicher Auswirkungen mikrobieller Impfmittel auf das Mikrobiom von Silagen die Abfolge von Bakterien- und Pilzpopulationen untersucht, die dominanten Mikroorganismen identifiziert, die an der Silierung beteiligt sind, und die Auswirkungen mikrobieller Impfmittel bewertet die epiphytische Gemeinschaft rehydrierter Mais- und Sorghumkörner und ihrer Silagen nach 0, 3, 7, 21, 90 und 360 Tagen Fermentation.

Das Experiment wurde zwischen Januar 2016 und Januar 2017 am Institut für Tierwissenschaften der Bundesuniversität von Vicosa (Viçosa, MG, Brasilien) durchgeführt, gelegen bei 20° 45′ S, 42° 52′ W, 663 m über dem Meeresspiegel. Der jährliche Niederschlag und die Durchschnittstemperatur im Versuchsjahr betrugen 1235,4 mm bzw. 20,7 °C.

Die in diesem Experiment verwendeten Proben stammen aus einer früheren Studie von21 (unveröffentlichte Daten), die die Auswirkungen von mikrobiellem Impfmittel und der Länge der Fermentationsperiode auf rehydrierte Mais- und Sorghumkornsilagen untersuchte. Die aktuelle Studie entspricht den brasilianischen ethischen Vorschriften. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Kurz gesagt, das Experiment wurde in einem vollständig randomisierten Design (mit drei Wiederholungen) basierend auf einem 2 × 3 × 6-Faktor-Assay mit zwei Körnern (Mais-CG und Sorghum-SG), drei Impfmitteln und sechs Fermentationsperioden (0 , 3, 7, 21, 90 und 360 Tage). Die bewerteten Behandlungen waren Maisbekämpfung (CG-CTRL), Mais Lalsil Milho (CG-Inoc1), Mais Lalsil AS (CG-Inoc2), Sorghumbekämpfung (SG-CTRL), Sorghum Lalsil Milho (SG-Inoc1) und Sorghum Lalsil AS (SG-Inoc2). Die Impfmittel bestanden aus CTRL – nicht inokuliert; Inoc1 – Lactobacillus plantarum > 3,0 × 1010 KBE g−1, Propionibacterium acidipropionici > 3,0 × 1010 KBE g−1 und Saccharose (Lalsil Milho, Lallemand Animal Nutrition); Inoc2 – Lactobacillus buchneri CNCM-I 4323 1,0 × 1011 KBE g−1 und Saccharose (Lalsil AS, Lallemand Animal Nutrition) mit einer Aufwandmenge von 105 KBE g−1.

Mais- und Sorghumkörner von einem örtlichen Bauernhof wurden in einer Mühle, die mit Sieben mit einer Maschenweite von 3 mm nachgerüstet wurde, grob zerkleinert. Vor der Fermentation wurden die gemahlenen Körner (mit Wasser) auf einen Feuchtigkeitsgehalt von 30 % rehydriert. Anschließend wurden die Impfmittel in der vom Hersteller empfohlenen Dosierung in destilliertem Wasser gelöst, auf 500 g rehydratisierte Körner gesprüht, gleichmäßig von Hand gemischt, in Plastikfolienbeutel (25,4 cm × 35,56 cm) verpackt und mit einem Vakuumierer (Eco) vakuumiert Vakuum 1040, Orved, Italien). Die gleiche Wassermenge wurde auf CTRL-Silagen aufgetragen.

Die Beutel wurden im Labor bei Raumtemperatur (Bereich 23–27 °C) gelagert. Von den insgesamt 108 Beuteln wurden 18 0, 3, 7, 21, 90 und 360 Tage nach der Fermentation geöffnet. Es wurden repräsentative Mischproben jeder Behandlung in jedem Fermentationszeitraum hergestellt, insgesamt also sechs Proben pro Fermentationszeitraum und insgesamt 36 Proben.

Die 36 Proben wurden in flüssigem Stickstoff zerkleinert und die gesamte DNA mit dem NucleoSpin Soil DNA Extraction Kit (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) gemäß den Empfehlungen des Herstellers extrahiert. Die DNA wurde mit einem Nanodrop-Spektrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, USA) quantifiziert und auf 1,4 % Agarosegel auf Qualität überprüft.

Kurz gesagt wurden PCR-Amplikonbibliotheken, die auf das 16S-rRNA-kodierende Gen in der metagenomischen DNA abzielen, unter Verwendung eines Barcode-Primer-Sets erstellt, das für Illumina HiSeq2000 und MiSeq22 angepasst ist. Anschließend wurden DNA-Sequenzdaten mithilfe der Illumina-Paired-End-Sequenzierung in der Environmental Sample Prepare and Sequencing Facility (ESPSF) am Argonne National Laboratory, USA, generiert. Insbesondere wurde die V4-Region des 16S-rRNA-Gens (515F-806R) mit regionsspezifischen Primern PCR-amplifiziert, die Sequenzer-Adaptersequenzen enthielten, die in der Illumina-Durchflusszelle verwendet wurden22,23.

Die Reaktion wurde mit einem maßgeschneiderten Peptidnukleinsäureblocker (PNA) ergänzt, der die Amplifikation kontaminierender Wirtssequenzen (Mitochondrien oder Plastiden) verhindern soll. Diese Blocker klammern sich während des PCR-Prozesses an Wirtssequenzen und verhindern deren Amplifikation24. Der Reverse-Amplification-Primer enthielt außerdem eine Barcode-Sequenz mit zwölf Basen, die das Zusammenführen von bis zu 2167 verschiedenen Proben in jeder Spur22,23 unterstützte.

Jede 25-µL-PCR-Reaktion enthielt 8,5 µL Mo BIO PCR-Wasser (zertifiziert DNA-frei), 12,5 µL AccuStart II ToughMix von QuantaBio (2 × Konzentration, 1 × Endgültigkeit), 1 µL Golay-Barcode-markierter Reverse-Primer (5 µM Konzentration, 200). pM final), 1 µL Forward Primer (5 µM Konzentration, 200 pM Final), 1 µL PNA-Blocker (Mitochondrien oder Plastid, 25 µM Konzentration, 1 µM Final) (Lundberg et al., 2013) und 1 µL Template-DNA . Die Bedingungen für die PCR waren wie folgt (Lundberg et al., 2013): 95 °C für 45 s, um die DNA zu denaturieren, gefolgt von 35 Zyklen bei 95 °C für 15 s, 78 °C für 10 s (für PNA-Annealing) , 50 °C für 30 s (für Primer-Annealing) und 72 °C für 30 s, mit einer Abkühlung auf 4 °C, sobald der Zyklus abgeschlossen ist. Die Amplikons wurden mit PicoGreen (Invitrogen, Waltham, USA) und einem Plattenlesegerät (Infinite 200 PRO, Tecan) quantifiziert. Nach der Quantifizierung wurden die Volumina jedes Produkts in einem einzigen Röhrchen zusammengefasst, sodass jedes Amplifikat in äquimolaren Mengen vertreten war. Dieser Pool wurde dann mit AMPure XP Beads (Beckman Coulter) gereinigt und mit einem Fluorometer (Qubit, Invitrogen) quantifiziert.

Nach der Quantifizierung wurde die Molarität des Pools bestimmt, auf 2 nM verdünnt, denaturiert und dann zur Sequenzierung mit Illumina MiSeq mit einem 10 % PhiX-Spike auf eine Endkonzentration von 6,75 pM verdünnt. Die Amplikons wurden in einem 251 bp × 12 bp × 251 bp großen MiSeq-Lauf unter Verwendung maßgeschneiderter Sequenzierungsprimer und -verfahren sequenziert22.

Für Pilzanalysen wurde die genomische DNA mithilfe eines speziell für Illumina HiSeq2000 und MiSeq angepassten Primer-Sets mit internem transkribiertem Spacer (ITS) mit Barcode amplifiziert. Diese Primer wurden von Kabir Peays Labor an der Stanford University entwickelt (Plos one; Smith, Peay 2014). Der Reverse-Amplification-Primer enthielt außerdem eine Barcode-Sequenz mit zwölf Basen, die das Zusammenführen von bis zu 2167 verschiedenen Proben in jeder Spur22,25 unterstützte. Jede 25-µL-PCR-Reaktion enthielt 12 µL Mo BIO PCR-Wasser (zertifiziert DNA-frei), 10 µL 5 Prime HotMasterMix (1 ×), 1 µL Forward Primer (5 µM Konzentration, 200 pM Endergebnis) und 1 µL Golay-Barcode markierter Reverse-Primer (5 µM Konzentration, 200 pM Endgültigkeit) und 1 µL Template-DNA. Die Bedingungen für die PCR waren wie folgt: 3 Minuten lang bei 94 °C, um die DNA zu denaturieren, gefolgt von 35 Zyklen bei 94 °C für 45 Sekunden, 50 °C für 60 Sekunden und 72 °C für 90 Sekunden, mit einer abschließenden Verlängerung von 10 Minuten bei 72 °C, um eine vollständige Amplifikation sicherzustellen. Die Amplikons wurden mit PicoGreen (Invitrogen) und einem Plattenlesegerät quantifiziert.

Nach der Quantifizierung wurden unterschiedliche Volumina jedes Produkts in einem einzigen Röhrchen zusammengefasst, sodass jedes Amplifikat gleichmäßig vertreten war. Dieser Pool wurde dann mit dem UltraClean PCR Clean-Up Kit (Mo BIO, Carlsbad, USA) gereinigt und mit einem Qubit (Invitrogen) quantifiziert. Nach der Quantifizierung wurde die Molarität des Pools bestimmt, auf 2 nM verdünnt, denaturiert und dann zur Sequenzierung mit Illumina MiSeq mit einem 10 % PhiX-Spike auf eine Endkonzentration von 6,75 pM verdünnt.

Rohe Sequenzierungsablesungen, die aus der 16S-rRNA- und ITS-rRNA-Amplikonsequenzierung erhalten wurden, wurden verschiedenen Qualitätsfilterungsschritten unterzogen. Sequenzen, die Basen mit einem maximal erwarteten Fehler von 0,05 Wahrscheinlichkeit zeigten, wurden entfernt, und die verbleibenden Sequenzen wurden mit dem Programm Usearch v.1126 in operative taxonomische Einheiten (OTUs) mit einem Schwellenwert von 97 % Ähnlichkeit gruppiert. Chimären wurden mit dem Uparse-Algorithmus27 entfernt. Das Programm ITSx v.1.0.1128 wurde verwendet, um nicht-pilzartige ITS1-Sequenzen zu entfernen.

Die taxonomische Annotation wurde mit dem Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) von QIIME v.1.9.125 durchgeführt, wobei die Datenbanken SILVA und UNITE für Bakterien- bzw. Pilzpopulationen verwendet wurden. Kontaminantensequenzen wie die von Chloroplasten und Mitochondrien wurden durch taxonomische Annotation entfernt. Alpha-Diversitätsmetriken (Chao1-Reichtum, Gleichmäßigkeit und Simpson-Diversität) wurden mit der R-Software (Version 2.15.3) berechnet.

Für die Variable Y wurden die Normalverteilung, die Poisson-Verteilung, die überhöhte Poisson-Verteilung, die nullveränderte Poisson-Verteilung und die Hurdle-Verteilung getestet. Basierend auf dem Abweichungsinformationskriterium (DIC) passte die Poisson-Verteilung am besten zu den Daten.

Das allgemeine statistische Modell ist unten angegeben:

wobei \(l\) der Vektor der latenten Variablen für das untersuchte Merkmal (y) ist; \(y\) ist der Vektor der Anzahl der Pilze (oder Bakterien); \({y}_{i}\sim Poisson({\lambda }_{i}=\mathrm{exp}\left({l}_{i}\right))\), wobei \(i=\ mathrm{1,2},\dots ,n\) und \(n\) ist die Anzahl der Beobachtungen; \(\lambda \) ist der kanonische Parameter dieser Verteilung (Poisson-Mittelwert); \(\mathrm{exp}\) ist die Umkehrfunktion der Poisson-Verteilung; \(b\) ist der Vektor systematischer Effekte (Mittelwert, Fermentationsdauer und Behandlung: CTRL, Inoc1 und Inoc2); \({u}_{1}\) ist der Vektor des Pilzarten- (oder Bakterien-)Spezieseffekts; \({u}_{2}\) ist der Vektor für die Wechselwirkung zwischen Pilztyp (oder Bakterien) und dem Effekt der Fermentationsdauer; \({u}_{3}\) ist der Vektor für die Wechselwirkung zwischen Pilztyp (oder Bakterien) und Impfwirkung; \({u}_{4}\) ist der Vektor für die Wechselwirkung zwischen Pilztyp (oder Bakterien), Fermentationsdauer und Impfwirkung. Somit wurde definiert, dass der Vektor der latenten Variablen eine multivariate Normalverteilung annimmt, die durch \(l|b,{u}_{1},{u}_{2},{u}_{3},{ u}_{4},{\sigma }_{1}^{2},{\sigma }_{2}^{2},{\sigma }_{3}^{2},{\sigma } _{4}^{2},{\sigma }_{e}^{2}\sim N(Xb+{Z}_{1}{u}_{1}+{Z}_{2}{u }_{2}+{Z}_{3}{u}_{3}+{Z}_{4}{u}_{4}, I{\sigma }_{e}^{2}) \), wobei \({\sigma }_{1}^{2},{\sigma }_{2}^{2},{\sigma }_{3}^{2},{\sigma }_ {4}^{2}\) und \({\sigma }_{e}^{2}\) sind die Varianzkomponenten, die mit \({u}_{1}, {u}_{2}\ verbunden sind ), \({u}_{3}, {u}_{4}\) bzw. \(e\) (Fehlervarianz).

Die angenommenen vorherigen Verteilungen für die Modellparameter waren:

Die angenommenen vorherigen Verteilungen für die Varianzkomponenten waren:

wobei IG die inverse Gammaverteilung ist, \({\alpha }_{1}\), \({\beta }_{1}\), \({\alpha }_{2}\), \( {\beta }_{2}\), \({\alpha }_{3}\), \({\beta }_{3}\), \({\alpha }_{4}\), \({\beta }_{4},{\alpha }_{e}\), gleich, zu \(0,001\) und \({\beta }_{e}\) sind bekannte Konstanten, die als Hyperparameter gleich bezeichnet werden \({10}^{8}.\)

Die statistische Schlussfolgerung der Parameter aus (\(b,{u}_{1},{u}_{2},{u}_{3},{u}_{4},{\sigma }_{ 1}^{2},{\sigma }_{2}^{2},{\sigma }_{3}^{2},{\sigma }_{4}^{2},{\sigma } _{e}^{2}\)) basierte auf hinteren Randverteilungen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Zufallsstichproben der hinteren Randverteilungen indirekt aus den vollständigen bedingten hinteren Verteilungen (fcpd) (Likelialitätsfunktion × vorherige Verteilung jedes Parameters) mithilfe von Markov-Ketten-Monte-Carlo-Algorithmen (MCMC) generiert wurden. Wenn fcpd als bekannte Familie von Wahrscheinlichkeitsverteilungen charakterisiert wird, kann der Gibbs-Sampler verwendet werden. Somit waren die aus fcpd generierten Werte nach einer ausreichend großen Anzahl von Iterationen Stichproben posteriorer Randverteilungen.

In der Analyse haben wir 2.000.000 Iterationen für die MCMC-Algorithmen zur vorherigen Ermittlung verschiedener Prozeduren verwendet und die ersten 100.000 Iterationen wurden als Burn-In verworfen. Nach der Durchführung jedes Satzes von zehn Iterationen (dünn) wurde eine Stichprobe zurückgehalten, um die Posterior-Statistiken zu berechnen. Die Konvergenz der Markov-Kette wurde durch Gewekes Diagnose verifiziert29.

Durch diese Analysen konnte überprüft werden, welche Effekte für das Vorkommen von Pilzen und Bakterien in Mais- und Sorghumkörnern von Bedeutung sind. Es wurde das Modell mit dem kleinsten DIC gewählt; Daher wurden diese Effekte als relevant erachtet, um die interessierende Variable zu erklären (Ergänzungstabelle S1). Wenn die Wechselwirkung zwischen der Art des Impfmittels und der Fermentationsdauer festgestellt wurde, haben wir jeden Faktor im Verhältnis zueinander untersucht. Somit wurde der Unterschied zwischen den Niveaus über das Glaubwürdigkeitsintervall ermittelt.

Die chemische Zusammensetzung, der pH-Wert und die Mikrobenpopulationen der gemahlenen und rehydrierten Mais- und Sorghumkörner sind in Tabelle 1 aufgeführt. Das durchschnittliche Fermentationsprofil und die Mikrobenpopulation der rehydrierten Mais- und Sorghumkornsilagen sind in der Ergänzungstabelle S2 dargestellt.

Insgesamt wurden 1.581.953 qualitativ hochwertige Messwerte generiert, wobei 783.146 dieser Messwerte aus den CG-Proben und 798.807 Messwerte aus SG an verschiedenen Fermentationstagen stammten. Die Anzahl der Sequenzen wurde im Verhältnis zur Mindestanzahl von 12.297 Sequenzen standardisiert, die aus einer einzelnen Probe erhalten wurden. Die Bakteriengemeinschaften in CG- und SG-Proben sind in den Ergänzungstabellen S3 bzw. S4 dargestellt. In CG- bzw. SG-Proben wurden insgesamt 257 bzw. 119 OTUs nachgewiesen. Die Verdünnungskurven von OTUs bei 97 % Sequenzidentität sind in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt. Die Sequenzierungstiefe reichte aus, um die Vielfalt der Bakterienpopulationen in Silagen vollständig zu beschreiben, da die Verdünnungskurven ein Plateau für die Sequenzen erreichten.

Der Simpson-Diversitätsindex der rehydrierten Mais- und Sorghumkornsilagen ist in Abb. 1 dargestellt. Die anfängliche Diversität des CG war zwischen den Behandlungen ähnlich. Während der Fermentationsperiode kam es zu einer Verringerung der Diversität, hauptsächlich bei CG-Inoc1-Silagen, aufgrund der geringeren Gleichmäßigkeit in diesen Silagen, da der Chao 1-Reichtum an den drei Tagen abnahm und zwischen den Behandlungen bis zum Ende der Fermentation ähnlich blieb Zeitraum. Die CG-Diversität nahm nach 360 Tagen zu und näherte sich den Ausgangswerten.

Chao 1 Reichhaltigkeit, Gleichmäßigkeit und Simpson-Vielfalt rehydrierter Mais- und Sorghumkorn-Silagen während der gesamten Fermentationsperiode (0, 3, 7, 21, 90 und 360 Tage). CTRL nicht inokuliert, Inoc1 Lactobacillus plantarum und Propionibacterium acidipropionici, Inoc2 Lactobacillus buchneri.

Numerisch gesehen hatten SG-Proben einen niedrigeren anfänglichen Diversitätsindex als CG-Proben, und der Diversitätsindex stieg ab Tag 3 an. Die Diversitätsreaktionen der Silagen in den verschiedenen Behandlungen waren ähnlich, mit Ausnahme von SG-Inoc1, das aufgrund der Verringerung der Gleichmäßigkeit niedrigere Anfangszahlen und verringerte Werte nach 90 Tagen Fermentation aufwies.

Beim Vergleich der Auswirkung der Inokulation auf die Bakterienhäufigkeit innerhalb jedes Fermentationszeitraums (Tabelle 2) wurde nach Schätzungen des Poisson-Modells die höchste Bakterienhäufigkeit in CG-CTRL-Silagen an den Tagen 0, 7 und 90 der Fermentation gefunden; Allerdings wurde bei diesen Silagen der niedrigste Wert nach 21 Tagen Gärung beobachtet. Nach 360 Tagen Fermentation wurde kein Unterschied zwischen den Impfmitteln festgestellt. Bei SG-Silagen förderte die Inokulation Unterschiede in der Bakterienhäufigkeit nur am Tag 0 der Fermentation, was zu SG-Inoc2-Silagen mit höherer Häufigkeit und SG-CTRL mit mittleren Werten führte, gefolgt von SG-Inoc1-Silagen.

Die Analyse des Verhaltens der Bakterienhäufigkeit während der Fermentationsperiode für jede Beimpfung (Tabelle 3) ergab Unterschiede in der Bakterienhäufigkeit während der Fermentationsperiode für alle Impfmittel in beiden Getreidesilagen. Die Häufigkeit von SG-Silagen war in unvergorenen Materialien (Tag 0) höher als in anderen, unabhängig von der Beimpfung, wohingegen in CG-Silagen kein Muster beobachtet wurde.

Analysen der relativen Häufigkeit von Bakteriengemeinschaften ergaben das Vorhandensein von neun bzw. sechs Phyla in CG und SG (ergänzende Abbildung S2). In beiden Körnern wurden die Phyla Actinobacteria, Bacteroides, Deinococcus-Thermus, Firmicutes und Proteobacteria gefunden. Der Stamm Cyanobacteria wurde in SG gefunden, und Acidobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes und Verrucomicrobia wurden nur in CG-Proben gefunden.

Das Überwiegen (> 80 %) von Proteobakterien wurde in beiden Körnern zu Beginn der Fermentation (Tag 0) beobachtet, mit Ausnahme von CG-CTRL und CG-Inoc1, die 51 % Proteobakterien bzw. 61 % Actinobakterien aufwiesen. In allen CG-Silagen dominierte Firmicutes phylum (> 84 %) die Fermentation 3 bis 90 Tage nach dem Silieren. Es gab eine Tendenz in der Bakteriengemeinschaft, nach 360 Tagen der Fermentation zu ihrer ursprünglichen Vielfalt zurückzukehren, wobei Firmicutes durch Proteobakterien und Actinobakterien ersetzt wurden.

Wie bei Phyla beobachtet, war die Anzahl der in den CG-Proben gefundenen Bakterienklassen höher als in den SG-Proben (16 vs. 9) (Abb. 2). Die Klassen Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Bacilli, Bacteroidia, Clostridia, Deinococci, Erysipelotrichia und Gammaproteobacteria wurden häufig in beiden Körnern gefunden. Oxyphotobakterien waren nur in SG vorhanden, während Acidobacteria, Deltaproteobacteria, Negativicutes, Planctomycetacia, Rubrobacteria, Thermoleophilia, TK10 und Verrucomicrobiae nur in CG-Proben gefunden wurden. Die Klassen Bacilli und Gammaproteobacteria waren die Hauptvertreter der Phyla Firmicutes bzw. Proteobacteria. Während der Fermentationsperiode waren die in diesen beiden Hauptstämmen beobachteten Veränderungen hauptsächlich das Ergebnis einer erhöhten oder verringerten Anzahl dieser beiden Klassen.

Klassen taxonomischer Profile von Bakteriengemeinschaften rehydrierter Mais- und Sorghumkornsilagen nach 0, 3, 7, 21, 90 und 360 Tagen Fermentation. CTRL nicht inokuliert, Inoc1 Lactobacillus plantarum und Propionibacterium acidipropionici, Inoc2 Lactobacillus buchneri.

Beide mikrobiellen Impfmittel begünstigten das Wachstum von Bakterien in CG- und SG-Silagen; Allerdings waren die in Inoc1 vorhandenen Bakterien wirksamer bei der Förderung von Veränderungen in der Bakterienpopulation beider Getreidesilagen bereits am 3. Tag der Fermentation.

Die Dynamik der Hauptgattungen in CG-Silagen ist in Abb. 3 dargestellt. Obwohl die Bacilli-Klasse während der Zwischenperioden der Fermentation vorwiegend in beiden Körnern vorkam, wurde die Abfolge der diese Klasse repräsentierenden Gattungen zwischen den Silagen unterschieden. Die anfängliche Gattungszusammensetzung der CG war bei den Behandlungen ungleichmäßig. Im CS-CTRL erfolgte die Fermentation ab dem 3. Tag überwiegend durch Weissela, mit allmählichem Ersatz durch die Gattung Lactobacillus, die nach 90 Tagen 93 % der Gattungen repräsentierte. Bakterien in Inoc1 induzierten die Dominanz (> 80 %) von Lactobacillus im Zeitraum von 3 bis 90 Tagen der Fermentation.

Hauptgattungsdynamik (%) der Bakteriengemeinschaften rehydrierter Maiskörnersilagen nach 0, 3, 7, 21, 90 und 360 Tagen Fermentation. CTRL nicht inokuliert, Inoc1 Lactobacillus plantarum und Propionibacterium acidipropionici, Inoc2 Lactobacillus buchneri.

Obwohl Lactobacillus am 21. und 90. Tag ≅ 90 % der Bakterien in CS-Inoc2 ausmachte, war das Impfmittel bei der Verhinderung der Entwicklung von Weissella und anderen Gattungen am 3. und 7. Tag der Fermentation nicht so wirksam wie Inoc1. Nach 360 Tagen wurde in den Silagen aller Behandlungen eine erhöhte Gleichmäßigkeit beobachtet, was zur Substitution von Lactobacillus führte. Die CS-Inoc1-Silagen hatten die höchsten Lactobacillus-Zahlen (50 %), was die größere Effizienz von Inoc1 bei der Aufrechterhaltung des Gleichgewichts der Bakterienpopulation im letzten ausgewerteten Zeitraum belegt. CS-Inoc2-Silagen waren diejenigen, die am häufigsten dazu neigten, zum ursprünglichen Populationsprofil zurückzukehren, mit einer relativen Häufigkeit von 32 % für Acinetobacter und 37 % für andere Gattungen.

Die Dynamik des Gattungsprofils in SG-Silagen ist in Abb. 4 dargestellt. Die Veränderungen der Bakteriengemeinschaft in den beimpften SG-Silagen waren komplexer als die in den CG-Silagen, was auf kompliziertere Wechselwirkungen zwischen der Bakterienflora hinweist. Im Gegensatz zu CG, dessen anfängliche Populationen heterogen waren, wies SG einen geringeren anfänglichen Reichtum und eine geringere Gleichmäßigkeit auf, was die Dominanz (51–80 %) der Gattung Pantoea widerspiegelte, hauptsächlich in SG-Inoc1-Silagen (80 %). Während der Fermentationsperiode kam es zu allmählichen, aber nicht vollständigen Gattungssubstitutionen durch unterschiedliche Anteile von Weissella, Lactobacillus und Bakterien der Familie Enterobacteriaceae.

Hauptgattungsdynamik (%) der Bakteriengemeinschaften rehydrierter Sorghumkornsilagen nach 0, 3, 7, 21, 90 und 360 Tagen Fermentation. CTRL nicht inokuliert, Inoc1: Lactobacillus plantarum und Propionibacterium acidipropionici, Inoc2 Lactobacillus buchneri.

Der Bakterienaustausch war während der Fermentationsperiode in SG-Silagen weniger ausgeprägt als in CG-Silagen. Ein hoher Prozentsatz (> 85 %) an Lactobacillus, wie er in CG-Inoc1 während der Anfangsstadien der Fermentation beobachtet wurde, trat ab 90 Tagen nur in SG-Inoc1-Silagen auf. SG-Inoc2 hatte ab dem 90. Tag eine ähnliche Bakterienfolge wie SG-CTRL, wobei in der Bakteriengemeinschaft verschiedene Gattungen vorhanden waren. Wie in CG nach 360 Tagen beobachtet, gab es Veränderungen in der taxonomischen Zusammensetzung der Bakterien, hauptsächlich den Ersatz von Lactobacillus durch Weissella in SG-CTRL-Silagen und Weissella und Kosakonia in SG-Inoc2. Allerdings fanden die Veränderungen bei SG hauptsächlich auf Familienebene statt, wohingegen bei den CG-Silagen auch Substitutionen auf Stammebene beobachtet wurden. Die SG-Inoc1-Probe zeigte nach 360 Tagen die größte Stabilität der Bakterienzusammensetzung, wobei 93 % von Lactobacillus stammten.

Insgesamt wurden 2.569.416 qualitativ hochwertige Messwerte erhalten, von denen 1.587.182 Messwerte und 982.334 Messwerte aus CG- bzw. SG-Proben an verschiedenen Fermentationstagen stammten. Die Qualität der nach 360 Tagen in SG-Inoc2 vorhandenen Sequenzen reichte nicht aus, um die Pilzgemeinschaft zu identifizieren. Die Anzahl der Sequenzen wurde relativ zur Mindestanzahl von 2863 Sequenzen standardisiert, die aus einer einzelnen Probe erhalten wurden.

Die Pilzgemeinschaften in CG und SG sind in den Ergänzungstabellen S5 bzw. S6 dargestellt. In CG- bzw. SG-Proben wurden insgesamt 71 bzw. 109 OTUs nachgewiesen. Die Verdünnungskurven von OTUs bei 97 % Sequenzidentität sind in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt. Die Sequenzierungstiefe reichte aus, um die Vielfalt der Pilzpopulationen in Silagen vollständig zu beschreiben, da die Verdünnungskurven ein deutliches Plateau für die Sequenzen erreichten.

Der Simpson-Diversitätsindex von Mais- und Sorghumkorn-Silagen ist in Abb. 5 dargestellt. Während des gesamten Fermentationszeitraums kam es bei allen Behandlungen zu Schwankungen in der Mykobiom-Diversität. Zahlenmäßig wies die CG-Inoc1-Silage zu Beginn der Fermentation eine geringere Diversität auf als andere CG-Silagen. Nach 90 Tagen war ein Rückgang der Diversität aller Behandlungen zu verzeichnen, die dann nach 360 Tagen wieder zunahm, hauptsächlich aufgrund von Schwankungen in der Gleichmäßigkeit. Im Allgemeinen war die Diversität der SG-Proben höher als die der CG-Proben. Wie bei CG nach 90 Tagen beobachtet, kam es bei allen SG-Behandlungen zu einer Verringerung der Diversität, insbesondere bei der SG-Inoc2-Silage, die nach 360 Tagen Fermentation wieder zunahm.

Pilz-Chao 1 Reichhaltigkeit, Gleichmäßigkeit, Simpson-Vielfalt von rehydrierten Mais- und Sorghumkorn-Silagen während der gesamten Fermentationsperiode (0, 3, 7, 21, 90 und 360 Tage). CTRL nicht inokuliert, Inoc1 Lactobacillus plantarum und Propionibacterium acidipropionici, Inoc2 Lactobacillus buchneri.

Nach Schätzungen des Poisson-Modells wurden bei der Analyse der Wirkung von Impfmitteln auf die Pilzhäufigkeit innerhalb jedes Fermentationszeitraums (Tabelle 4) die höchsten Werte für CG-CTRL und die niedrigsten Werte für CG-Inoc2-Silagen nach 0 Tagen beobachtet 3 Tage Gärung. In den anderen Fermentationsperioden wurde jedoch kein Unterschied beobachtet, und es wurde kein Unterschied in der Pilzhäufigkeit von SG-Silagen am 0. und 360. Tag der Fermentation beobachtet. Allerdings zeigten SG-Inoc1-Silagen die höchsten Werte nach 3 und 21 Tagen Gärung. Die niedrigsten Häufigkeiten wurden in den SG-CTRL- und SG-Inoc2-Silagen an den Tagen 7 bzw. 90 beobachtet.

Die Auswirkungen jeder Impfung auf die Pilzhäufigkeit während des Fermentationszeitraums in beiden Körnern sind in Tabelle 5 dargestellt. Die Pilzhäufigkeit unterschied sich nicht zwischen CG-Inoc1-, CG-Inoc2-, SG-CTRL- und SG-Inoc1-Silagen und nahm bei CG-CTRL ab und SG-Inoc2-Silagen während der gesamten Fermentationsperiode.

In beiden Körnern wurden die Stämme Ascomycota, Basidiomycota und Mucoromycota gefunden. Ascomycota war in allen Proben vorherrschend, mit wenigen Abweichungen in Gegenwart der anderen Phyla (Ergänzende Abbildung S4).

In beiden Körnern wurden nicht identifizierte Pilze und die anderen elf Klassen gefunden (Abb. 6). Die Klassen Agaricomycetes, Dothideomycetes, Eurotiomycetes, Microbotryomycetes, Mucoromycetes, Saccharomycetes, Sordariomycetes, Tremellomycetes und Wallemiomycetes wurden in beiden Körnern gefunden, während Orbiliomycetes und Pezizomycetes nur in CG-Proben und Agaricostilbomycetes und Cystobasidiomycetes in SG-Proben gefunden wurden. Saccharomycetes und Eurotiomycetes wurden überwiegend in CG gefunden, während Dothideomycetes und Saccharomycetes die Hauptklassen waren, die in der SG-Pilzfermentation gefunden wurden. In CG-CTRL- und CG-Inoc2-Silagen waren etwa die Hälfte der Anfangspopulationen Mikroorganismen der Eurotiomycetes-Klasse, mit kleineren Anteilen von Sordariomycetes und Tremellomycetes. Am dritten Tag der Gärung kam es in beiden Silagen zu einem starken Anstieg der Saccharomyceten, mit allmählicher Verdrängung durch Eurotiomyceten, deren Vorherrschaft (> 80 %) sich auf bis zu 360 Tage verlängerte. Dothideomyceten machten in SG-Proben 56–92 % der ursprünglichen Population aus. Auch Tremellomyceten waren vor der Fermentation in der SG-Inoc1-Silage in erheblichen Mengen vorhanden. Die anfänglichen Populationen wurden durch Saccharomyceten ersetzt, wobei die Dominanz in allen Silagen bis zu 90 Tage anhielt. Nach 360 Tagen ersetzten einflussreiche Mengen Eurotiomycetes die Saccharomycetes-Mikroorganismen in den SG-CTRL- und SG-Inoc1-Silagen.

Taxonomische Klassenprofile von Pilzgemeinschaften rehydrierter Mais- und Sorghumkornsilagen nach 0, 3, 7, 21, 90 und 360 Tagen Fermentation. CTR nicht inokuliert, Inoc1 Lactobacillus plantarum und Propionibacterium acidipropionici, Inoc2 Lactobacillus buchneri.

Die Hauptgattungsdynamik von Maiskörnersilagen ist in Abb. 7 dargestellt. Aspergillus spp. repräsentierten 51–89 % der ursprünglichen Population in CG-Proben. Sein Vorherrschen (89 %) in CG-Inoc1-Silagen nach 0 Tagen führte zu der geringsten anfänglichen Diversität in diesen Silagen und war auch für den starken Rückgang der Diversität in allen CG-Silagen nach 90 Tagen verantwortlich. In CG-CTRL-Silagen kam es bereits drei Tage nach der Gärung zu einem Wachstum von Wickerhamomyces-Hefen (60 %), die die Gärung bis zum 21. Tag dominierten. Ab dem 90. Tag bis zum Ende der Fermentation dominierte wieder Aspergillus. Eine ähnliche Reaktion wurde bei CG-Inoc2-Silage beobachtet; Allerdings repräsentierte Aspergillus nach 7 bzw. 21 Tagen bereits 54 % bzw. 88 % der Gattungen. Die in Inoc1 vorhandenen Bakterien führten bis zu 90 Tage lang zu einer Fermentation mit einem überwiegenden Anteil von Aspergillus. Nach 360 Tagen waren jedoch 86 % der Gattungen ausschließlich durch nicht identifizierte Hefen vertreten, die zu Saccharomycetales gehörten.

Hauptgattungsdynamik (%) von Pilzgemeinschaften rehydrierter Maiskörnersilagen nach 0, 3, 7, 21, 90 und 360 Tagen Fermentation. CTRL nicht inokuliert, Inoc1 Lactobacillus plantarum und Propionibacterium acidipropionici, Inoc2 Lactobacillus buchneri.

Die Hauptgattungsdynamik von Sorghumkornsilagen ist in Abb. 8 dargestellt. In den anfänglichen SG-Proben wurde eine größere Beteiligung verschiedener Gattungen beobachtet als in den CG-Proben. Alternaria spp. machten 30–60 % der ursprünglichen Population der Silagen aus. Darüber hinaus wurden größere Mengen nicht identifizierter Pilze der Ordnung Pleosporales beobachtet, hauptsächlich in SG-Inoc2-Proben (60 %). Wickerhamomyces anomalus dominierte die Population aller Silagen in den Zwischenperioden der Gärung, mit einer geringen Beteiligung anderer Gattungen. Wie zuvor beobachtet, nahm die Vielfalt der SG-CTRL- und SG-LM-Silagen nach 360 Tagen aufgrund erhöhter Gleichmäßigkeitswerte zu, was die stärkere Beteiligung anderer Gattungen wie Monascus, Candida und Aspergillus an der Silagevergärung widerspiegelt.

Hauptgattungsdynamik (%) von Pilzgemeinschaften rehydrierter Sorghumkornsilagen nach 0, 3, 7, 21, 90 und 360 Tagen Fermentation. CTRL nicht inokuliert, Inoc1 Lactobacillus plantarum und Propionibacterium acidipropionici, Inoc2 Lactobacillus buchneri.

Einige OTUs in SG-Proben wurden auf Artenebene klassifiziert und umfassten Amylostereum chailletii, Aspergillus flavus, Exserohilum turcicum, Hyphoderma setigerum, Kwoniella heveanensis, Kwoniella mangroveensis, Monascus purpureus, Mucor circinelloides, Nigrospora oryzae, Phialemoniopsis curvata, Resinicium saccharicola und Rhizopus arrhi zus, Rhodotorula diobovata, Rhodotorula mucilaginosa, Schizophyllum commune, Setophoma sacchari, Sterigmatomyces halophilus, Strelitziana eucalypti, Wallemia ichthyophaga, W. anomalus, Xeromyces bisporus und Zygoascus hellenicus.

Die ähnlichen anfänglichen Bakteriengemeinschaften in SG spiegelten die minimalen unmittelbaren Auswirkungen der Behandlungen auf die mikrobielle Gemeinschaft zu Beginn des Zeitverlaufs und das Fehlen signifikanter Unterschiede bei exogenen mikrobiellen Kontaminanten wider, die die mikrobielle Zusammensetzung verändern könnten30. Das Vorherrschen von Proteobakterien im Rohmaterial wurde auch von Romero et al.31 und McGarvey et al.32 in Mais- bzw. Luzerneproben berichtet. Darüber hinaus war die Anwesenheit von Actinobakterien in der ursprünglichen Zusammensetzung von CG-Inoc1 viel höher (61 %) als die von Romero et al.31 in Maisproben beobachtete (4,5 %).

Die hohe Häufigkeit von Firmicutes und die geringe Häufigkeit von Proteobakterien in beiden Getreidesilagen nach der Fermentation wurde auch bei verwelktem Vollkornhafer, der 217 Tage lang siliert wurde33, und bei Luzernensilage, die mit verschiedenen mikrobiellen Impfmitteln beimpft wurde, beobachtet13. Daher tragen die Umgebungsbedingungen während der Silierung zum Wachstum des Firmicutes-Stamms14 bei und gewährleisten die Erhaltung von Kleinkornsilagen34.

In Grassilage waren die meisten dem Stamm Firmicutes zugeordneten Lesevorgänge mit der Ordnung Lactobacillales verbunden, die die drei am weitesten verbreiteten Gattungen Lactobacillus, Lactococcus und Weissella umfasst35. In unserer Studie wies die Gattung Acinetobacter nach 360 Tagen auch einflussreiche Mengen in der CG-Inoc2-Silage auf. Acinetobacter spp. sind aerobe, nicht fermentierende Bakterien, die in verschiedenen Umgebungen vorkommen36. Einige Arten können in einer anaeroben Umgebung in Gegenwart von Acetat als Substrat überleben37 und benötigen Energie aus dem Kohlenhydratabbau38. Die erhöhte Häufigkeit von Acinetobacter in der CG-Inoc2-Silage nach 360 Tagen könnte auf die erhöhte Acetatkonzentration zurückzuführen sein, die durch den inokulierten L. buchneri-Stamm erzeugt wurde, wie nach 90 Tagen der Fermentation beobachtet wurde (Ergänzungstabelle S2). Dies könnte teilweise die geringen, wenn auch erheblichen Verluste an Trockenmasse (TM) erklären, die manchmal in Silagen beobachtet werden, die während der Silierung mit diesen heterofermentativen Bakterien behandelt wurden39.

Die Verringerung der Bakterienvielfalt in CG-Silagen und SG-Silagen, die mit Inoc1 nach 3 bzw. 90 Tagen der Fermentation beimpft wurden, kann durch die Dominanz von Lactobacillus bei der Anwendung von L. plantarum enthaltendem Impfmittel erklärt werden. Ogunade et al.40 berichteten auch über eine geringe Bakterienvielfalt, die auf die hohe Häufigkeit von Lactobacillus in Maissilage zurückzuführen ist. Je häufiger also das dominierende Bakterium vorkommt, desto weniger vielfältig ist die mikrobielle Gemeinschaft41,42. Laut McDonald et al.43 werden nach der anaeroben Fermentation die komplexen mikrobiellen Gemeinschaften der Rohstoffe nach und nach durch Milchsäurebakterien (LAB) ersetzt, und Lactobacillus kann bei erfolgreichen Silagen zu einer dominanten Gattung werden. Tatsächlich stiegen, wie in Tabelle 1 und Ergänzungstabelle S2 gezeigt, die LAB-Kultur-abhängigen Zahlen an und Enterobakterien und Pilze verringerten sich bei allen Behandlungen während des gesamten Fermentationszeitraums allmählich.

Die erhöhte Häufigkeit von Lactobacillus in Silagen könnte auf ihre Fähigkeit zurückzuführen sein, zusätzlich zu wasserlöslichen Kohlenhydraten (WSC) auch Stärke oder Zellulose zu verwenden, da die Expression von Amylasen und sowohl 1–4- als auch 1–6-Glucosidasen in aus Sorghum isoliertem amylolytischem LAB erfolgt ist wurde zuvor von Velikova et al.44 berichtet. Muck45 berichtete, dass die aktuellen Stämme von L. buchneri im Vergleich zu denen anderer Arten eher langsam sind. Daher können andere LAB die Hauptarbeit der Fermentation übernehmen, und nach der aktiven Fermentation wandeln die L. buchneri-Stämme Milchsäure langsam in Essigsäure um. Das bedeutet, dass es eine Weile dauern kann, bis ihre Wirkung auf die aerobe Stabilität beobachtet wird, typischerweise 45–60 Tage nach der Fermentation.

In unserer Studie machte die Gattung Lactobacillus nach 7 Tagen der Fermentation 73 % bzw. 51 % der Mikrobenpopulation in CG-Inoc2- und SG-Inoc2-Silagen aus. Daten aus dem Fermentationsprofil von Silagen (Ergänzungstabelle S2) legen nahe, dass die Produktion von Essigsäure durch L. buchneri nach 90 Tagen erfolgte, hauptsächlich in SG-Inoc2-Silagen. Daher können wir spekulieren, dass andere Arten der Gattung Lactobacillus während der anfänglichen Fermentation dieser Silagen als Starterkulturen fungierten, wie von Muck45 vorgeschlagen. Obwohl P. acidipropionici in der Zusammensetzung von Inoc1 vorkam, wurden interessanterweise keine Vertreter dieser Gattung in den Silagen beider Getreidearten gefunden. Diese Propionbakterien gehören zur Klasse der Actinobacteria, die hauptsächlich in der ursprünglichen Population von CG-Inoc1 vorkam und durch verschiedene Gattungen vertreten wurde, darunter Brevibacterium, Streptomyces und Arthrobacter. Laut Filya et al.46 scheint die Kombination von P. acidipropionici und L. plantarum nicht vielversprechend für den Schutz von Weizen-, Sorghum- und Maissilagen vor aerober Belastung zu sein. Im Allgemeinen war Propionibacterium in Situationen wirksam, in denen der pH-Abfall gering ist und/oder wenn der End-pH-Wert der Silage relativ hoch ist (> 4,2–4,5)47, was in unserer Studie hauptsächlich bei SG-Silagen beobachtet wurde. Das Fehlen dieser Gattung in allen Proben war unerwartet, insbesondere in den kürzlich inokulierten Proben (Tag 0).

Bakterien der Gattung Weissella sind streng heterofermentativ und produzieren eine Mischung aus Laktat und Acetat als Hauptendprodukte des Zuckerstoffwechsels48,49. Einige Arten wurden aus einer Vielzahl von Quellen wie Erde, frischem Gemüse, Fleisch, Fisch, fermentierter Silage und Lebensmitteln isoliert50,51,52. In Übereinstimmung mit Muck53, der darauf hinwies, dass die größte Abweichung in der mikrobiellen Gemeinschaft in Maissilage in warmen Klimazonen zu liegen scheint, wo Weissella- und Leuconostoc-Arten zu den frühen Stadien der Fermentation beitrugen, wurde in unserer Studie die Fermentation von CG-CTRL-Silagen bis dahin durchgeführt Die 21-tägige Gärung wurde ebenfalls von Weissella spp. dominiert. Darüber hinaus wurde es durch das Vorhandensein dieser Gattung in den SG-Silagen während der gesamten Fermentationsperiode beeinflusst.

Pang et al.54 gaben an, dass mehrere Weissella spp. könnte die Silagequalität verbessern. Darüber hinaus berichteten Ndagano et al.55 über die Produktion von Acetat und anderen antimykotischen Verbindungen wie 3-Hydroxy-Fettsäuren und Phenyllactat durch Weissella paramesenteroides, die aus fermentiertem Manihot esculenta isoliert wurde. Cai et al.56 kamen jedoch zu dem Schluss, dass heterofermentative Stämme von W. paramesenteroides die Silagequalität nicht verbesserten und aufgrund des stärkeren Wachstums von aeroben Bakterien und Clostridien, des hohen pH-Werts, der Buttersäure- und Ammoniakstickstoffkonzentrationen sowie der niedrigeren Milchsäure zu einem gewissen Fermentationsverlust führen könnten Säuregehalt in Luzerne- und Italienischem Weidelgras-Silagen. Der Einfluss der Gattung Weissella auf die Silagegärung ist noch widersprüchlich und unklar.

Verdorbene Silagen zeichnen sich manchmal durch einen hohen Anteil der Enterobacteriaceae-Familie aus57. Mehrere Arten, darunter Salmonellen und Escherichia coli, stehen in engem Zusammenhang mit Krankheiten bei Mensch und Tier. Das einflussreiche Vorkommen von Enterobacteriaceae in SG-Silagen wurde hauptsächlich durch die Gattung Pantoea repräsentiert, gefolgt von kleineren Anteilen von Kosakonia. Die Gattung Pantoea ist eine äußerst vielfältige Gruppe, deren Mitglieder in aquatischen und terrestrischen Umgebungen sowie in Verbindung mit Pflanzen, Insekten, Menschen und Tieren vorkommen58. McGarvey et al.32 berichteten außerdem, dass Pantoea eine der am häufigsten vorkommenden Gattungen in der Bakteriengemeinschaft der Luzerne ist. Das Vorhandensein dieser Gattung während des gesamten Fermentationszeitraums in SG-Silagen widerspricht den Erkenntnissen von Si et al.13, wonach die Gattung in Luzernensilage nach 30 Tagen verschwand. Die Autoren berichteten auch, dass diese Bakterien negativ mit den Essigsäure- und Ammoniakstickstoffkonzentrationen und positiv mit dem WSC-Gehalt korrelierten. Jacxsens et al.59 berichteten, dass Pantoea agglomerans unter anaeroben Bedingungen Zucker zu Säuren fermentieren und auch Milchsäure verwenden kann, was zu Nährstoffverlusten führt.

Die Beimpfung beider Körner mit Inoc1 führte zu Silagen, die von der Gattung Lactobacillus dominiert wurden und eine viel geringere Diversität aufwiesen als CTRL und Inoc2. SG-Inoc2-Silagen könnten mehr Pantoea, Kosakonia und andere Enterobacteriaceae ernähren, die möglicherweise pathogene Bakterienarten enthalten könnten. Somit kann der Zusatz von Inoc1 auch zur Sicherheit von SG-Silagen beitragen.

Wenn der pH-Wert nicht ausreichend gesenkt wird oder Sauerstoff zur Verfügung steht, können sich in der Silage zahlreiche weitere unerwünschte Mikroorganismen entwickeln. Einige Arten von Bazillus, Clostridium, Listeria, Mycobacterium, Yersinien und Salmonellen werden mit Krankheiten bei Mensch und Tier in Verbindung gebracht60. Pseudomonas- und Klebsiella-Arten können biogene Amine produzieren, die häufig mit einer Verringerung des Proteingehalts und des Nährwerts der Silage verbunden sind61. Von diesen Gattungen wurden in unserer Studie nur Bacillus, Clostridium und Pseudomonas sowohl in Getreide als auch in Mycobacterium in CG-Proben nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Die Anzahl der zu diesen Gattungen gehörenden OTUs war jedoch in allen Silagen relativ gering, was auf die in den Silagen vorhandenen Spurenmengen an Buttersäure zurückzuführen ist (Ergänzungstabelle S2).

Liu et al.14 berichteten auch über eine erhöhte Reichhaltigkeit und Vielfalt, mit einem deutlichen Rückgang der Firmicutes und einem Anstieg der Proteobakterien in der Bakteriengemeinschaft, in Gerstensilagen nach längerer aerober Exposition. Daher ist der Grund für die Veränderungen in der Bakteriengemeinschaft nach 360 Tagen in unserer Studie unklar, da die experimentellen Bedingungen der Anaerobiose über den gesamten Zeitraum konstant waren. Darüber hinaus beschränken sich Studien zur Analyse von Bakteriengemeinschaften auf kürzere Fermentationszeiten, was es schwierig macht, die beobachteten Ergebnisse mit denen früherer Studien zu korrelieren.

Im Gegensatz zu den Berichten von Dunière et al.60, in denen Silage aufgrund der Versauerung lange gelagert werden konnte, widerlegen Veränderungen in der endgültigen Silagegemeinschaft in beiden Körnern nach 360 Tagen die Annahme, dass sich die Bakteriengemeinschaft nach einer bestimmten Fermentation stabilisiert Zeitraum. Dies deutet darauf hin, dass selbst bei einem konstanten pH-Wert Änderungen im mikrobiellen Profil von Getreidesilagen zu unerwünschten Veränderungen, wie z. B. höheren Konzentrationen von NH3-N und Propionsäure und niedrigeren LAB-Werten, im Fermentationsprofil von über einen langen Zeitraum gelagerten Silagen führen können .

Bemerkenswerterweise war das epiphytische Mykobiomprofil der Körner vor der Fermentation unterschiedlich, was zu unterschiedlichen Auswirkungen des mikrobiellen Impfmittels auf die Pilzpopulation der silierten Materialien führte. Das Vorherrschen von Ascomycota und das Vorhandensein geringerer Mengen von Basidiomycota und Zygomycota wurden auch in verwelktem Hafer, Mais und deren Silagen beobachtet31,62,63. In unserer Studie wurde jedoch Mucoromycota anstelle von Zygomycota gefunden. Darüber hinaus waren Ascomycota und Basidiomycota die Hauptstämme des Purpurprärieklees (Dalea purpurea Vent.)16.

Die Ascomycota-Gruppe ist für den Menschen als Quelle von Arzneimitteln und Lebensmitteln, aber auch als Krankheitserreger von Menschen und Pflanzen von besonderer Bedeutung. Laut Romero et al.31 steigt die aerobe Stabilität bei einer hohen relativen Häufigkeit nicht identifizierter Ascomycota-Arten in Maissilage, was darauf hindeutet, dass dieser Mikroorganismus möglicherweise das Wachstum anderer Mikroben, die für den aeroben Verderb verantwortlich sind, eingeschränkt hat.

Obwohl in allen Proben das Vorherrschen von Ascomycota beobachtet wurde, unterschieden sich die Mykobiomprofile zwischen den Körnern. Das Vorherrschen nicht identifizierter Aspergillus-Arten in der CG-Probe sowie von Alternaria und anderen nicht identifizierten Pilzen der Ordnung Pleosparales in SG-Proben vor der Fermentation zeigte die hohe Häufigkeit von Schimmelpilzen in vorsilierten Körnern, auch ohne sichtbare Symptome einer Pilzkontamination. Pleosporale Schimmelpilze werden typischerweise mit Blattflecken an Pflanzen in Verbindung gebracht. Daher wurde das Vorkommen dieser Gattung erwartet, da viele Pilze während ihrer Reifung auf dem Feld in der Phyllosphäre der Pflanzen leben und möglicherweise noch vorhanden sind, bevor eine absolute Anaerobiose erreicht ist62.

Die meisten Pilzmikroorganismen sind streng aerob, und einige Penicillium-, Fusarium- und Aspergillus-Arten bleiben nach der Verarbeitung bestehen63. Daher sind in allen gemischten mikrobiellen Populationen von Silagen bestimmte Arten wie Aspergillus, Penicillium, Fusarium und Monascus64 besser an eine verringerte O2-Spannung, einen niedrigeren pH-Wert und höhere Konzentrationen von Kohlendioxid und organischen Säuren angepasst65.

Laut Gulbis et al.66 sind die am häufigsten aus Maissilage isolierten Arten Pilze der Gattungen Alternaria, Fusarium und Penicillium. In der vorliegenden Studie wurden Penicillium und Fusarium spp. waren während der Silagegärung in geringer Menge vorhanden. Während des gesamten Fermentationszeitraums wurde die CG-Fermentation von Aspergillus-Schimmelpilzen dominiert, während W. anomalus-Hefe in den SG-Proben vorherrschte. Das Fortbestehen und Vorherrschen von Aspergillus während der Fermentationsperiode in CG-Silagen weist daher darauf hin, dass diese Gattung gegenüber Silierbedingungen toleranter ist als Alternaria und andere Pleosparal-Schimmelpilze, die vor der Fermentation in SG vorkommen.

Aspergillus spp. ist weltweit verbreitet und gehört zu den vorherrschenden Arten, die in verschiedenen Silagen in Brasilien vorkommen67. Für das Wachstum sind hohe Temperaturen und eine geringe Wasseraktivität erforderlich, und es kann in mikroaerophilen und sauren Umgebungen überleben68. Darüber hinaus gehören Mykotoxine, die von Aspergillus-Arten produziert werden, zu den vier Hauptgiften, die in Maissilage vorkommen69. Das Vorherrschen der Gattung Aspergillus in CG-Inoc1-Silagen seit Beginn der Fermentation lässt darauf schließen, dass das Impfmittel das Wachstum einiger Hefen, insbesondere der Wickerhamomyces-Arten, hemmte. Allerdings war die erhöhte Häufigkeit nicht identifizierter Hefen der Ordnung Saccharomycetales nach 360 Tagen unerwartet, und der Grund dafür ist unklar.

Es ist bekannt, dass mehrere Faktoren, darunter die während der Silagelagerung eingedrungene Luftmenge und die Art der silierten Kulturpflanzen, die Zusammensetzung der Hefeflora in der Silage beeinflussen70. Da während der gesamten Fermentationsperiode anaerobe Bedingungen aufrechterhalten wurden, wird vermutet, dass die unterschiedlichen Hefegemeinschaftsprofile zwischen den Körnern durch die Kulturart und andere Faktoren beeinflusst werden können71. Wie bereits erwähnt, ist das Vorhandensein von etwas Hefe in der Silage mit einem anaeroben Gärverlust und einer aeroben Verschlechterung verbunden, nachdem die Silage während der Tierfütterung der Luft ausgesetzt wurde, oder es kommt zu Schäden an der Abdichtung des Silos70. Zusätzlich zu den Verlusten der Silagequalität können Hefen auch opportunistische Krankheitserreger sein72, die die in vitro scheinbare Verdauung neutraler Reinigungsmittelfasern verringern73.

Hefen wie die in dieser Studie gefundene Wickerhamomyces-Art gehören zur Ordnung der Saccharomycetales und werden häufig mit dem Verderb oder der Verarbeitung von Lebensmitteln und Getreideprodukten in Verbindung gebracht. Saccharomycetales spp. sind auch im Pilzkernmikrobiom von Kleinkornsilagen vorherrschend34. Wickerhamomyces anomalus, früher bekannt als Pichia anomala, Hansenula anomala oder Candida pelliculosa, wurde der Gattung Wickerhamomyces72 zugeordnet. Es handelt sich um eine biotechnologisch relevante Hefeart, die in vielfältigen Lebensräumen vorkommt74. Das Vorherrschen dieser Art während der Fermentation von SG-Silagen hängt mit ihrer Fähigkeit zusammen, extreme Umweltbedingungen wie oxidativen, salzigen und osmotischen Stress sowie pH- und Temperaturschocks zu tolerieren75. Aufgrund dieser Eigenschaften kann dieser Mikroorganismus jedoch zum Verderb mehrerer Produkte führen, darunter Silage und Milchprodukte76,77.

Laut Druvefors et al.78 ist W. anomalus eine vielversprechende Alternative zu chemischen Fungiziden bei der Lagerung von Getreidekörnern, da es antimykotische Metaboliten produziert, die aus der Glykolyse stammen, und nicht aus der Konkurrenz um Nährstoffe oder der Aktivität zellwandlytischer Enzyme. Auch Ethanol und Ethylacetat werden für die antimykotische Wirkung dieser Art verantwortlich gemacht. In diesem Zusammenhang müssen die Auswirkungen von W. anomalus auf die Silagevergärung noch geklärt werden.

Die Auswirkungen von Impfmitteln auf die Bakterien- und Pilzsukzession unterschieden sich zwischen den beiden Getreidesorten. Lactobacillus und Weissella sind die Hauptbakterien, die an der Fermentation rehydrierter Silagen von Mais- und Sorghumkörnern beteiligt sind. Aspergillus spp. waren bei der Fermentation von rehydriertem Maiskörner vorherrschend, während W. anomalus die Hauptpilzart in rehydrierten Sorghumkornsilagen war. Das L. plantarum und P. acidipropionici enthaltende Impfmittel förderte wirksamer ein starkes Wachstum von Lactobacillus und sorgte für eine höhere Stabilität der Bakteriengemeinschaft während längerer Lagerungszeiten in Silagen beider Körner. Darüber hinaus kontrollierte es das Wachstum der Wickerhamomyces-Hefe bis zum 90-tägigen Fermentationstag in rehydrierten Maiskörnersilagen. Die Bakterien- und Pilzgemeinschaften rehydrierter Mais- und Sorghumkorn-Silagen blieben nach 360 Tagen Lagerung nicht stabil.

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Wir danken dem National Institute of Science and Technology of Animal Science (INCT-CA Brasilien); Nationaler Rat für wissenschaftliche und technologische Entwicklung (CNPq); Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES) und Minas Gerais Research Funding Foundation (FAPEMIG) für die Forschungsunterstützung.

Fabyano Fonseca e Silva ist verstorben.

Abteilung für Tierwissenschaften, Bundesuniversität Vicosa, Avenida PH. Rolfs, Vicosa, Mina Gerais, 36570-900, Brasilien

Mariele Cristina Nascimento Agarussi, Odilon Gomes Pereira, Felipe Evangelista Pimentel, Vanessa Paula da Silva und Fabyano Fonseca e Silva

Abteilung für Statistik, Bundesuniversität Vicosa, Avenida PH. Rolfs, Vicosa, 36570-900, Brasilien

Camila Ferreira Azevedo

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MCNA führte die Laboranalysen durch und erstellte das Manuskript. OGP entwarf die Experimente und trug zum Verfassen des Manuskripts bei. FEP trug zu den Versuchsproben bei. VPS war an der Erstellung des Manuskripts beteiligt. CFA und FFS führten die statistischen Analysen durch. Alle Autoren haben das Manuskript rezensiert.

Korrespondenz mit Odilon Gomes Pereira.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Agarussi, MCN, Pereira, OG, Pimentel, FE et al. Mikrobiom rehydrierter Mais- und Sorghumkornsilagen, die in verschiedenen Fermentationsperioden mit mikrobiellen Impfmitteln behandelt wurden. Sci Rep 12, 16864 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21461-4

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Eingegangen: 05. März 2022

Angenommen: 27. September 2022

Veröffentlicht: 07. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21461-4

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