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Jan 17, 2024

Malat-Synthase trägt zum Überleben von Salmonella Typhimurium gegen Nährstoff- und oxidative Stressbedingungen bei

Scientific Reports Band 12, Artikelnummer: 15979 (2022) Diesen Artikel zitieren 1168 Zugriffe 1 Zitate Metrikdetails Um im Wirt zu überleben und sich zu vermehren, hat S. Typhimurium mehrere entwickelt

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 15979 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Um im Wirt zu überleben und sich zu vermehren, hat S. Typhimurium mehrere Stoffwechselwege entwickelt. Der Glyoxylat-Shunt ist ein solcher Weg, der Acetat für die Synthese von Glucose und anderen Biomolekülen nutzen kann. Dieser Weg ist eine Umgehung des TCA-Zyklus, bei dem CO2-erzeugende Schritte weggelassen werden. Zwei am Glyoxylatzyklus beteiligte Enzyme sind Isocitratlyase (ICL) und Malatsynthase (MS). Wir haben den Beitrag von MS zum Überleben von S. Typhimurium unter kohlenstofflimitierenden und oxidativen Stressbedingungen bestimmt. Der ms-Gen-Deletionsstamm (∆ms-Stamm) wuchs normal in LB-Medien, konnte jedoch in M9-Minimalmedien, denen Acetat als einzige Kohlenstoffquelle zugesetzt war, nicht wachsen. Allerdings zeigte der ∆ms-Stamm eine Überempfindlichkeit (p < 0,05) gegenüber Hypochlorit. Darüber hinaus war der ∆ms-Stamm deutlich anfälliger für Neutrophile. Interessanterweise wurde nach der Inkubation von S. Typhimurium mit Neutrophilen eine mehrfache Induktion des ms-Gens beobachtet. Darüber hinaus zeigte der Stamm ∆ms eine fehlerhafte Kolonisierung in Milz und Leber von Geflügel. Kurz gesagt, unsere Daten zeigen, dass die MS zur Virulenz von S. Typhimurium beiträgt, indem sie dessen Überleben unter Bedingungen von Kohlenstoffmangel und oxidativem Stress unterstützt.

Basierend auf der Antigenpräsentation1 werden Salmonella enterica-Serovare in Typhus- und Nicht-Typhus-Salmonellen (NTS) eingeteilt. Die WHO erkennt NTS weltweit als eine der drei häufigsten durch Lebensmittel übertragenen bakteriellen Erkrankungen beim Menschen an. Alte, junge und immungeschwächte Personen sind sehr anfällig für eine Salmonelleninfektion2. Unter den NTS wird das Serovar Typhimurium weltweit am häufigsten bei Patienten isoliert3.

Nach der Einnahme widersteht ein Teil der Mikroorganismen dem niedrigen pH-Wert des Magens, dringt in die Darmschleimhaut ein und repliziert sich in der Submukosa und den Peyer-Plaques4. Nach der Darmpenetration erhält S. Typhimurium Zugang zu den mesenterialen Lymphknoten, wo die Bakterien von phagozytischen Zellen wie Makrophagen verschlungen werden5. Sobald sich S. Typhimurium in den Makrophagen befindet, wird es in eine modifizierte Vakuole unterteilt, die als „Salmonella-haltige Vakuole“ (SCV) bekannt ist und ein zentrales Merkmal für das intrazelluläre Überleben und Wachstum dieses Bakteriums darstellt6. Die Verschlingung durch den Makrophagen drängt S. Typhimurium somit in ein fremdes Milieu, das reich an verschiedenen antimikrobiellen Mitteln ist und keine wichtigen Nährstoffe enthält, die für den Stoffwechsel und die Replikation unerlässlich sind. Um unter solch rauen Bedingungen zu überleben, moduliert S. Typhimurium die Funktionen von Phagozyten auf verschiedene Weise. Erstens behindern Effektoren, die vom Typ-III-Sekretionssystem von S. Typhimurium kodiert werden, den Aufbau der phagosomalen Oxidase und hemmen folglich die Produktion von Superoxidradikalen. Zweitens fungiert das SCV als Schutzschild für S. Typhimurium, das nicht nur die lysosomale Fusion verhindert, sondern auch die Exposition der enthaltenen Bakterienzellen gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen begrenzt7. Während die primären Antioxidantien von S. Typhimurium Oxidationsmittel direkt löschen, stellen die Reparaturenzyme die Funktionen der beschädigten Biomoleküle wieder her8,9.

Das Überleben gegen den antimikrobiellen Angriff im Phagolysosom hängt jedoch von der Fähigkeit der Mikrobe ab, die Proteine ​​und andere Biomoleküle zu synthetisieren, die zur Abwehr von Stress erforderlich sind. Daher muss ein Krankheitserreger die erforderlichen Nährstoffe finden, um die Bausteine ​​für diese komplexen Makromoleküle bereitzustellen, und die Energie, mit der er sie synthetisieren kann10. Es ist die metabolische Flexibilität von S. Typhimurium, die es ihm ermöglicht, unter solch rauen Bedingungen im Wirt zu überleben11. Die Fähigkeit, seinen Nährstoffbedarf aus alternativen Quellen zu decken, könnte eine wichtige Rolle für die Eignung von S. Typhimurium im Wirt spielen. Ein solcher Überlebensmechanismus ist die Existenz des Glyoxylatzyklus, dessen Hauptfunktion darin besteht, das Wachstum von Bakterien/Zellen zu ermöglichen, wenn C2-Verbindungen wie Ethanol und Acetat die einzigen Kohlenstoffquellen sind12. Nur wenige Studien legen nahe, dass Makrophagen reich an Fettsäuren sind. Beim Stoffwechsel erzeugen Fettsäuren Acetyl-CoA, das in Acetat13, ein Substrat für den Glyoxylatzyklus, umgewandelt werden kann.

Der Glyoxylat-Shunt besteht aus sechs der acht Reaktionen des TCA-Zyklus, umgeht jedoch die beiden oxidativen Schritte, in denen Kohlendioxid entsteht14. Die beiden einzigartigen Enzyme des Glyoxylatzyklus sind Isocitratlyase (ICL, kodiert durch aceA15) und Malatsynthase (MS, kodiert durch aceB16). Während ICL die Spaltung von Isocitrat zu Succinat und Glyoxylat katalysiert, kondensiert MS Glyoxylat mit einer Acetylgruppe von Acetyl-CoA zu produzieren Malat. Das Nettoergebnis des Glyoxylatzyklus ist die Produktion von Malat und Succinat aus zwei Molekülen Acetyl-CoA, die aus Acetat oder dem Abbau von Ethanol, Fettsäuren oder Poly-β-hydroxybutyrat abgeleitet sind17.

Es wurde vermutet, dass der Glyoxylatzyklus möglicherweise zum Überleben von Mikroorganismen unter oxidativem Stress und zur Pathogenese beiträgt. Nur wenige Studien zu Pilz- und Bakterienpathogenen haben auf eine Hochregulierung der Gene des Glyoxylatzyklus nach der Phagozytose hingewiesen. Bei E. coli, die unter Superoxidstress leiden, wird ein erhöhter Stoffwechselfluss (48 %) durch den Glyoxylat-Shunt beobachtet18. Eine kürzlich durchgeführte Studie an M. tuberculosis zeigte eine erhöhte Anfälligkeit des ms-Knockdown-Stamms gegenüber oxidativem und nitrosativem Stress sowie Makrophagen19. Es wurde vermutet, dass ICL für die Persistenz von Salmonellen während einer chronischen Infektion bei Mäusen erforderlich ist20.

Zuvor haben wir gezeigt, dass der ms-Gen-Deletionsstamm eine fehlerhafte Kolonisierung im Blinddarm von Geflügel aufwies9. Darüber hinaus neigen Met-Reste von MS zur Oxidation und können durch Methioninsulfoxidreduktase repariert werden. Die Rolle von MS für das Überleben von S. Typhimurium unter oxidativen Stressbedingungen ist jedoch nicht bekannt. In der vorliegenden Studie wollten wir den Beitrag von ms zum Überleben von S. Typhimurium bei oxidativem Stress und zur Besiedlung in Leber und Milz von Geflügel untersuchen. Durch den Einsatz verschiedener biochemischer, molekularbiologischer Instrumente sowie Zellkultur- und Lebendtierstudien zeigen wir, dass die ms für das Wachstum von S. Typhimurium unter Kohlenstoffmangel und das Überleben unter oxidativen Stressbedingungen erforderlich sind. Schließlich legen unsere Daten nahe, dass das ms zum Überleben von S. Typhimurium in phagozytischen Zellen sowie in der Milz und Leber von Geflügel beiträgt.

Die Wachstumsrate des Δms-Stammes war vergleichbar mit der von S. Typhimurium in LB-Brühe. Der Δms-Stamm konnte jedoch in M9-Medien, denen Acetat als einzige Kohlenstoffquelle zugesetzt war, nicht wachsen (Abb. 1 und ergänzende Abb. 1). Darüber hinaus beobachteten wir die Induktion des Malat-Synthase-Proteins in S. Typhimurium, das in mit Acetat ergänzten M9-Medien kultiviert wurde (ergänzende Abbildung 2). Die Immunreaktivität der MS-Bande war in den Lysaten von S. Typhimurium, die in mit Acetat ergänzten M9-Minimalmedien gezüchtet wurden, im Vergleich zu Bakterien, die in mit Glucose versetzten Medien kultiviert wurden, sehr intensiv (ergänzende Abbildung 2a). Die Belastung des SDS-Gels war jedoch für beide Bedingungen nahezu ähnlich (ergänzende Abbildung 2b).

Der Δms-Stamm konnte auf Acetat als einziger Kohlenstoffquelle nicht wachsen: Über Nacht gewachsene Kulturen von WT- und Δms-Stämmen von S. Typhimurium wurden in LB-Brühe (A) oder M9-Medium, ergänzt mit entweder 0,4 % Glucose (B) oder 0,4 % Acetat, verdünnt ( C) und auf einem Schüttelinkubator gezüchtet. Die Aliquots wurden im Abstand von 1 Stunde entnommen und die optischen Dichten bei 600 nm gemessen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt.

Zuvor haben wir über eine durch Oxidationsmittel vermittelte Oligomerisierung und Met-SO-Bildung in der Malat-Synthase9 berichtet. Um unsere Ergebnisse zu untermauern, haben wir die Carbonylierung mittels Oxyblot beurteilt, wenn Malat-Synthase anfällig für Oxidation ist. Carbonylierung ist ein anerkannter Marker zur Beurteilung der Proteinoxidation21. Unsere Oxyblot-Analyse zeigte eine viel intensivere Bande in der dem Oxidationsmittel ausgesetzten Malatsynthase im Vergleich zur Kontrolle (ergänzende Abbildung 3).

HOCl ist eines der stärksten Oxidationsmittel, das durch die Myeloperoxidase-katalysierte Reaktion zwischen H2O2 und Chloridionen entsteht. Wir haben die Anfälligkeit des Δms-Stammes gegenüber HOCl untersucht. Es wurde festgestellt, dass die prozentuale Erholung des Δms-Stammes um bis zu 9,39 % bzw. 0,013 % verringert war, verglichen mit 42,31 % bzw. 0,141 % im Fall von WT nach Behandlung der Zellen mit 1,5 bzw. 3 mM HOCl (Abb. 2). .

Der Δms-Stamm von S. Typhimurium ist überempfindlich gegenüber HOCl: WT- und Δms-Stämme von S. Typhimurium wurden in LB-Brühe bis zur späten stationären Phase gezüchtet. Anschließend wurden die Kulturen 2 Stunden lang den angegebenen Konzentrationen von NaOCl ausgesetzt. Nach der Exposition wurden die Kulturen seriell verdünnt und auf HEA-Platten ausplattiert. Nach der Inkubation der Platten wurden die Kolonien gezählt, ausgedrückt als Prozentsatz der gewonnenen lebensfähigen Zellen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SE (n = 3) angezeigt und sind repräsentativ für zwei Experimente. * p < 0,05.

Neutrophile sind die wichtigsten HOCl-produzierenden Zellen. Nachdem wir die Anfälligkeit des Δms-Stamms gegenüber dem Reagenz HOCl beobachtet hatten, untersuchten wir die Rolle des ms-Gens beim Überleben von S. Typhimurium gegen die durch Neutrophile vermittelte Abtötung. Neutrophile wurden mit WT- oder Δms-Stämmen von S. Typhimurium inkubiert. Durch retrospektive Ausplattierung betrug die beobachtete MOI für WT- und Δms-Stämme 1:7 bzw. 1:8,5 (Neutrophile: Bakterien). Nach 15-minütiger Inkubation wurde festgestellt, dass die prozentuale Erholung des Δms-Stammes um bis zu 8,47 % reduziert war, verglichen mit 16,42 % im Fall von WT nach Inkubation mit Neutrophilen (Abb. 3). Tatsächlich war der Δms-Stamm deutlich anfälliger (p < 0,0001) für die durch Neutrophile vermittelte Abtötung.

Der Δms-Stamm zeigt eine Überempfindlichkeit gegenüber Neutrophilen: Die Neutrophilen wurden mit WT- und Δms-Stämmen von S. Typhimurium bei einer MOI von 10:1 (Bakterien:Zellen) infiziert. Nach 15-minütiger Inkubation wurden die Neutrophilen durch Triton X-100 lysiert. Die Lysate wurden seriell verdünnt und auf HE-Agarplatten ausplattiert. Nach der Inkubation der Platten wurden die Kolonien gezählt. Dargestellt ist ein Vergleich des Prozentsatzes der wiederhergestellten WT- und Δms-Stämme von S. Typhimurium nach 0 Minuten und 15 Minuten nach der Infektion. Die Daten werden als Mittelwert ± SE (n = 5) dargestellt. ****p < 0,0001.

Nachdem wir die Überempfindlichkeit des Δms-Stamms gegenüber Neutrophilen beobachtet hatten, bewerteten wir die Expression von ms nach der Inkubation von S. Typhimurium mit Neutrophilen. Das S. Typhimurium wurde 15 Minuten lang mit Neutrophilen kokultiviert und die relative Expression des ms-Gens wurde durch qRT-PCR analysiert. Wir beobachteten eine 3,82-fache Hochregulierung von ms in S. Typhimurium nach Inkubation mit Neutrophilen (ergänzende Abbildung 6).

Geflügel ist eines der wichtigsten Reservoire für S. Typhimurium in der Natur, das Infektionen über Eier und Fleisch überträgt. Nach einer kurzen enterischen Phase gelangt S. Typhimurium in Milz und Leber, wo es verschiedene phagozytische Zellen angreift. Wir haben die Bakterienbelastung in der Milz und Leber des Geflügels am 7., 14. und 21. Tag nach der Infektion bestimmt. In der Milz von mit dem WT-Stamm infizierten Vögeln fanden wir zu jedem Zeitpunkt nach der Infektion Bakterien. Die Anzahl der am 7., 14. und 21. Tag wiedergewonnenen S. Typhimurium wurde in log10 KBE/Milz (Mittelwert ± SE) ausgedrückt. Die Anzahl der wiederhergestellten WT-Stämme betrug 1,4 ± 0,36, 1,3 ± 0,61 bzw. 0,6 ± 0,37. Allerdings war das Überleben des ∆ms-Stamms in der Milz beeinträchtigt und wir konnten mutierte Bakterien nur bis zu 14 Tage nach der Infektion erholen. Die Zählungen betrugen 0,58 ± 0,36 und 0,64 ± 0,4 am 7. bzw. 14. Tag (Abb. 4).

Quantifizierung der bakteriellen Belastung in der Milz nach oraler Infektion von Vögeln mit WT- oder Δms-Stämmen von S. Typhimurium: Die Milz wurde in sterilem PBS homogenisiert und 100 μl Homogenat wurden auf HEA-Platten ausplattiert. Die KBE pro Milz wurden 7 und 14 Tage nach der Infektion (dpi) berechnet. Die Daten werden als Mittelwert ± SE (n = 5) dargestellt. * p < 0,05.

In der Leber haben wir bis 14 Tage nach der Infektion Bakterien sowohl von WT- als auch von ∆ms-Stamm-infizierten Vögeln gewonnen und die Werte als log10 KBE/g Leber ausgedrückt (Mittelwert ± SE). Die Anzahl der wiedergefundenen WT-Bakterien betrug 7 bzw. 14 Tage nach der Infektion 0,86 ± 0,5 bzw. 2,37 ± 1,0. Bei mit dem ∆ms-Stamm infizierten Vögeln erholten wir uns am 7. und 14. Tag nach der Infektion um 0,4 ± 0,4 bzw. 0,4 ± 0,4 (Abb. 5). 14 Tage nach der Infektion war die Bakterienlast in der Leber von mit dem ∆ms-Stamm infizierten Vögeln signifikant (p < 0,05) niedriger als in der WT-infizierten Gruppe.

Analyse der bakteriellen Belastung in der Leber nach oraler Infektion von Vögeln mit WT- oder Δms-Stämmen von S. Typhimurium: Die Leber (100 mg) wurde in sterilem PBS homogenisiert und 100 μl Homogenat wurden auf HEA-Platten ausplattiert. Die KBE pro Gramm Leber wurden 7 und 14 Tage nach der Infektion (dpi) berechnet. Die Daten werden als Mittelwert ± SE (n = 5) dargestellt. *p < 0,05.

Um im Wirt zu gedeihen, muss sich S. Typhimurium mit der nährstoff-/kohlenstofflimitierenden und oxidantienreichen Umgebung der phagozytischen Zellen auseinandersetzen. Um die Rolle des Glyoxylatzyklus in S. Typhimurium unter diesen beiden Bedingungen (Kohlenstoffmangel und oxidativer Stress) zu beurteilen, haben wir das Malat-Synthase-Gen gelöscht und die Löschung durch PCR9 bestätigt. Der Δms-Stamm wuchs normal in LB-Medium oder M9-Minimalmedium, ergänzt mit Glucose (Abb. 1A, B und ergänzende Abb. 1). Der Δms-Stamm zeigte jedoch einen vollständigen Wachstumsdefekt, wenn er in M9-Minimalmedium kultiviert wurde, dem Acetat als einzige Kohlenstoffquelle zugesetzt war (Abb. 1C und ergänzende Abb. 1).

Über die Induktion von Glyoxylat-Shunt-Enzymen wurde bei S. Typhimurium berichtet, das in acetathaltigen Medien kultiviert wurde22. Wir beobachteten eine enorme (mehr als 20-fache) Induktion des Malat-Synthase-Proteins in S. Typhimurium, das in mit Acetat ergänzten M9-Minimalmedien gezüchtet wurde, im Vergleich zu Kulturen in mit Glucose ergänzten M9-Minimalmedien (ergänzende Abbildung 2). Diese Daten deuten auf eine zentrale Rolle der Malatsynthase beim Überleben von S. Typhimurium unter kohlenstofflimitierenden Bedingungen hin.

Unter oxidativem Stress wurde die Aktivierung der Enzyme des Glyoxylat-Shunts bei verschiedenen Mikroorganismen beobachtet, darunter Pseudomonas aeruginosa23, M. tuberculosis24, Alishewanella25 und Acinetobacter oleivorans26. Bioinformatische Analysen legen nahe, dass die Mikroorganismen, in denen der Glyoxylatzyklus funktioniert, entweder aerob oder fakultativ anaerob sind23. Die Verwendung von Sauerstoff zur Oxidation von Nährstoffen und zur Energiegewinnung durch Atmung erzeugt Superoxide, Wasserstoffperoxid und die hochreaktiven Hydroxylradikale18. Daher stoßen Mikroorganismen aufgrund des oxidativen Ausbruchs von Phagosomen sowie aufgrund ihres normalen aeroben Stoffwechsels auf potenziell tödliche Mengen dieser ROS27. Tatsächlich dient NADH in erster Linie der Bildung von ATP, seine Oxidation während der aeroben Atmung ist jedoch für die Bildung des größten Teils der endogenen ROS28 verantwortlich. Ein erhöhter Metabolitenfluss durch den Glyoxylat-Shunt anstelle des TCA-Zyklus verringert die Menge der NADH-Produktion aus Glucose. Die Verringerung der NADH-Erzeugung verringert die Gesamt-ROS, da die durch den Zellstoffwechsel erzeugten Superoxide minimal sind18. Darüber hinaus ist die Isocitratdehydrogenase (IDH) in Bakterien, die in Acetat wachsen können, im Gegensatz zu Eukaryoten an NADP und nicht an NAD gebunden. Bei oxidativem Stress fungiert NADH als wichtigstes Nicotinamid-Nukleotid-Reduktionsmittel28. Aufgrund der größeren Reaktivität mit Fe3+, die durch die Fenton-Reaktion erzeugt wird, sinken die NADH-Spiegel im Vergleich zu NADPH schnell. In Übereinstimmung mit der oben genannten Hypothese zeigten Paraquat-gestresste E. coli eine erhöhte Produktion von Acetat und Flux im Glyoxylatzyklus, was zu einem erhöhten NADPH:NADH-Verhältnis führte18. Daher scheint die NADP-Abhängigkeit bakterieller IDHs eine Anpassung an das Wachstum auf Acetat zu sein, wobei der Glyoxylatzyklus den NADH-Spiegel verringert, ohne seine Hochregulierung durch NADP-vermittelte Phosphorylierung von IDH zu gefährden. Diese interessanten Erkenntnisse weisen auf den möglichen Beitrag des Glyoxylatzyklus zum Überleben von Mikroorganismen unter oxidativem Stress hin.

Dies veranlasste uns, die Auswirkung der Deletion des ms-Gens auf das Überleben von S. Typhimurium sowohl unter Kohlenstoffmangel als auch unter oxidativen Stressbedingungen zu untersuchen. Um diese beiden Bedingungen nachzuahmen, setzten wir nährstoffarme Zellen (aufgewachsen bis zur späten stationären Phase) HOCl aus. Der Δms-Stamm war im Vergleich zum WT-Stamm von S. Typhimurium anfälliger (p < 0,05) gegenüber HOCl (Abb. 2), was auf eine wichtige Rolle des Malatsynthase/Glyoxylat-Zyklus beim Überleben von S. Typhimurium unter oxidativem Stress schließen lässt. Der Malat-Synthase-Gen-Deletionsstamm von P. aeruginosa zeigte eine Überempfindlichkeit gegenüber Paraquat, einem chemischen Oxidationsmittel23. Eine andere Studie zeigte die Überempfindlichkeit von Mutanten von P. aeruginosa in Enzymen des Glyoxylatzyklus gegenüber H2O229.

Neutrophile sind die wichtigsten HOCl-produzierenden Zellen. Daher haben wir die Rolle von ms beim Überleben von S. Typhimurium gegen Neutrophile untersucht. Im Vergleich zum WT-Stamm von S. Typhimurium war der Δms-Stamm sehr anfällig (p < 0,0001) für Neutrophile (Abb. 3). Enzyme des Glyoxylatzyklus tragen zum Überleben verschiedener Krankheitserreger gegen phagozytische Zellen bei. Der ICL-defiziente Stamm von Rhodococcus equi30 und der ms-Knockdown-Stamm von M. tuberculosis19 zeigten nach Exposition gegenüber phagozytischen Zellen ein fehlerhaftes Überleben.

Nachdem wir die Überempfindlichkeit des Δms-Stamms gegenüber Neutrophilen beobachtet hatten, fragten wir uns, ob das ms-Gen nach der Inkubation von S. Typhimurium mit Phagozyten induziert wird. Tatsächlich beobachteten wir eine 3,82-fache Induktion der Malat-Synthase nach der Inkubation von S. Typhimurium mit Neutrophilen. Upregulation of glyoxylate cycle genes following phagocytosis have been observed in fungal pathogens like Paracoccidioides brasiliensis31, Penicillium marneffei32, Aspergillus fumigatus33, Cryptococcus neoformans34 and Candida albicans35 as well as in several bacterial pathogens like P. aeruginosa36, M. tuberculosis (Munoz-Elias and McKinney 2005 ) und R. equi30. Die in der prekären Nische der Phagolysosomen eingeschlossenen Mikroorganismen müssen die verfügbaren Kohlenstoffquellen nutzen, um unter Nährstoffmangel und anderen Stressbedingungen überleben zu können. Phagozyten sind reich an Fettsäuren, die die Aktivierung der Enzyme des Glyoxylatzyklus im Phagosom induzieren könnten37. Eine Studie deutete auf den Import von Fettsäuren aus Wirts-Triacylglyceraldehyden (TAGs) in M. tuberculosis38 hin. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass in S. Typhimurium die Gene für den Lipidstoffwechsel und den Glyoxylatzyklus für die Kolonisierung in Mausgeweben wie Blinddarm, Peyer-Plaques, mesenterialen Lymphknoten, Milz und Leber essentiell sind39. In einem Co-Kultur-Experiment mit Makrophagen wurde festgestellt, dass die Gene für den Lipidimport, die β-Oxidation und den Glyoxylatzyklus für das Überleben von S. Typhimurium notwendig sind39. Eine interessante Möglichkeit für die Bildung einfacher Verbindungen in Phagozyten könnte daher der Abbau von Fettsäuren durch β-Oxidation sein, der zu Acetyl-CoA führt, einem Substrat für den Glyoxylatzyklus10.

Bei Hühnern findet im Blinddarm eine umfangreiche Bakterienvermehrung statt40. Danach gelangen die Bakterien in das retikuloendotheliale System41 und schließlich in Milz, Leber und Knochenmark. Zuvor haben wir gezeigt, dass Malat-Synthase zur Kolonisierung von S. Typhimurium im Blinddarm von Geflügel beiträgt9. Milz und Leber sind die wichtigen Organe, die an der Immunantwort gegen S. Typhimurium41 beteiligt sind. Es wurde vermutet, dass die Replikation von S. Typhimurium im SCV eines einzelnen Phagozyten entweder in der Leber oder der Milz während einer akuten Infektion begrenzt ist42, allerdings steigt die Bakterienzahl in der Leber durch Ausbreitung von einem auf nahegelegene andere Phagozyten und bildet so eine Infektionsherd43. Obwohl S. Typhimurium in infizierten Phagozyten nur schlecht wächst, wächst es in den zahlreichen Herden der Leber in großer Zahl43. Diese Beobachtungen legen nahe, dass sich die Verfügbarkeit von Stoffwechselsubstraten im Phagosom im Verlauf der Infektion verändern kann, wobei bei chronischen Infektionen eine zunehmende Abhängigkeit von der Fettsäure- und Acetatverwertung auftritt. S. Typhimurium moduliert die Milzfunktionen auf eine Weise, sodass die Milz als sicherer Hafen für dieses Bakterium dient44,45. Als nächstes untersuchten wir den Beitrag der Malatsynthase zum Überleben von S. Typhimurium in der Milz und Leber von Geflügel. Die Verbreitung des Δms-Stamms in der Milz (p < 0,001) und der Leber (p < 0,01) war geringer als die des WT-Stamms von S. Typhimurium (Abb. 4 und 5). Die Beteiligung von icl als Virulenzdeterminante wurde bei verschiedenen pathogenen Organismen wie M. tuberculosis (Munoz-Elias und McKinney 2005), R. equi30 und P. aeruginosa36 beobachtet. Bei S. Typhimurium ist icl für chronische Infektionen erforderlich, nicht jedoch für akute tödliche Infektionen bei Mäusen20.

Um im Wirt zu überleben, müssen bakterielle Krankheitserreger, einschließlich S. Typhimurium, über eine Reihe von Reaktionssystemen zur Stressbewältigung verfügen. Das Vorhandensein mehrerer Stoffwechselwege sorgt für metabolische Flexibilität, die bei der Nutzung verschiedener Metaboliten/Substrate hilft, die in einer bestimmten Nische verfügbar sind. Es wurde gezeigt, dass der vollständige Tricarbonsäurezyklus (TCA) während der Infektion von Mäusen mit S. Typhimurium abläuft46. Der glykolytische Weg ist für die intrazelluläre Replikation von S. Typhimurium in Mäusen und Makrophagen erforderlich und Glucose ist der Hauptzucker, den S. Typhimurium während der Infektion von Makrophagen verwendet47. Um Glukose und andere Zwischenprodukte des TCA-Zyklus bei Nährstoffmangel und Stress wieder aufzufüllen, spielt der Glyoxylatzyklus eine entscheidende Rolle bei der Bereitstellung der notwendigen Energie, die für die Replikation und das Überleben im Wirt erforderlich ist.

Diese Beobachtungen legen nahe, dass sich die Verfügbarkeit von Stoffwechselsubstraten im Wirt im Laufe der Infektion verändern kann, wobei bei chronischen Infektionen eine zunehmende Abhängigkeit von der Fettsäure- und Acetatverwertung auftritt. Insbesondere könnten diese Enzyme dem Redoxstoffwechsel potenzielle metabolische Flexibilität verleihen, indem sie den katabolen Kohlenstofffluss effektiv von der NADPH-Bildung entkoppeln, die parallel zum Tricarbonsäurezyklus stattfinden würde. Daher könnten im Fall von S. Typhimurium die zentralen Enzyme des Glyoxylatzyklus in verschiedenen Phasen erforderlich sein, um seinen Stoffwechsel- und Energiebedarf zu decken48 und sein Überleben unter oxidativen Stressbedingungen zu unterstützen.

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), Indian Council of Agricultural Research-Indian Veterinary Research Institute (ICAR-IVRI), Izatnagar, Indien, mit der Genehmigungsdatei Nr. F.1.53/2012-13-JD genehmigt. Res). Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien und Vorschriften der IAEC, ICAR-IVRI, Izatnagar, Indien, durchgeführt.

Salmonella enterica Unterart Enterica Serovar Typhimurium Stamm 5591 (S. Typhimurium), ein Geflügelisolat, wurde aus dem Depot des National Salmonella Centre-Veterinary, Indian Veterinary Research Institute (IVRI), Izatnagar, Indien, bezogen. Der ms-Gen-Deletionsmutantenstamm in S. Typhimurium (∆ms-Stamm) wurde wie zuvor beschrieben9 geheilt und durch PCR bestätigt. Bakteriologische Medien wie Luria Bertani (LB)-Agar, LB-Brühe und Hektoen Enteric-Agar (HEA) wurden von HiMedia Laboratories Pvt. bezogen. Ltd., Mumbai, Indien. Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) wurde gemäß dem Standardprotokoll49 hergestellt.

Isolierte Kolonien von S. Typhimurium- und ∆ms-Stämmen wurden in 10 ml LB-Brühe inokuliert und bei 37 °C unter Schütteln bei 180 U/min gezüchtet. Über Nacht gewachsene Kulturen wurden (@ 1:100) in frischen 50 ml LB-Medium verdünnt und auf einem Schüttelinkubator gezüchtet. In Abständen von einer Stunde wurden Aliquote entnommen und die optischen Dichten bei 600 nm gemessen.

Das Wachstum von S. Typhimurium- und Δms-Stämmen wurde auch in M9-Minimalmedien, ergänzt mit Acetat oder Glucose als einziger Kohlenstoffquelle, bewertet. Kurz gesagt, über Nacht gewachsene LB-Kulturen wurden pelletiert und mit M9-Minimalmedium gewaschen. Die gewaschenen Pellets wurden dann in M9-Medium, ergänzt mit 0,4 % Acetat oder 0,4 % Glucose, gezüchtet.

Über Nacht gewachsene Kulturen von S. Typhimurium und ∆ms-Stämmen wurden verschiedenen Konzentrationen von HOCl (Natriumhypochlorit, NaOCl, Sigma) ausgesetzt. Nach 2-stündiger Inkubation bei 37 °C/180 U/min wurden die Kulturen seriell verdünnt und auf HEA-Platten ausplattiert. Nach der Inkubation der Platten über Nacht wurden die Kolonien gezählt.

Neutrophile wurden wie an anderer Stelle beschrieben50 mit geringfügigen Modifikationen isoliert. Die Empfindlichkeitstests wurden gemäß dem Protokoll von Okamura und Spitznagel51 mit geringfügigen Änderungen durchgeführt. Kurz gesagt, das Blut wurde aus der Halsvene gesunder erwachsener Ziegen in einem mit EDTA beschichteten Vacutainer gesammelt. Die Neutrophilen wurden durch ein Doppeldichtezentrifugationsverfahren unter Verwendung von Histopaque 1119/1077 (Sigma-Aldrich, USA) isoliert. Die Zellen wurden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung und einmal mit HBSS ohne Ca2+/Mg2+-Salze (HBSS −) bei 250 × g für 10 Minuten gewaschen. Die Gesamtzahl lebensfähiger Zellen wurde mit der Trypanblau-Ausschlussmethode gezählt und unter Verwendung von HBSS (–)-Medium auf eine Konzentration von 2 × 106 Zellen/ml eingestellt. Die in der Mitte des Protokolls gewachsenen Kulturen der S. Typhimurium- und ∆ms-Stämme wurden pelletiert, gewaschen und in HBSS suspendiert. Die Neutrophilen- und Bakteriensuspensionen wurden mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 1:10 (Zelle:Bakterien) gemischt. Die Mischung wurde 15 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 in einer befeuchteten Kammer inkubiert. Um den tatsächlichen MOI zu bestimmen, wurden die Bakteriensuspensionen seriell verdünnt und auf Agarmedien ausplattiert. Nach 15-minütiger Inkubation mit Neutrophilen und Bakterien wurden die Suspensionen 3 Minuten lang bei 13.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde 5 Minuten lang mit 0,1 % Triton X-100 lysiert. Lysate wurden seriell verdünnt und auf HEA-Platten ausplattiert. Nach der Inkubation der Platten über Nacht wurden die Kolonien gezählt.

Die Expressionsanalyse des msgens erfolgte mittels qRT-PCR. Neutrophile wurden 15 Minuten lang mit S. Typhimurium infiziert, wie im obigen Abschnitt beschrieben. RNA aus dem geernteten Pellet wurde mit Trizol-Reagenz isoliert. Als Kontrolle diente aus mit LB-Brühe gewachsenen Kulturen isolierte RNA. Die qRT-PCR wurde gemäß dem im Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific) beschriebenen Protokoll durchgeführt. Kurz gesagt, für eine 20-μl-Reaktion wurden 500 ng RNA mit 1 μl Zufallsprimer (100 pmol), 1 μl dNTP-Mix (10 mM), 4 μl 5× RT-Puffer und 1 μl Maxima H gemischt Minus Enzymmischung. cDNA wurde durch Inkubation der obigen Mischung bei 25 °C für 10 Minuten, gefolgt von 50 °C für 15 Minuten und Beendigung bei 85 °C für 5 Minuten, synthetisiert. Die Expressionsniveaus des ms-Gens in jeder Probe wurden bewertet und unter Verwendung von DNA-Gyrase B (gyrB) als interne Kontrolle52 normalisiert. Für eine 20 μl qRT-PCR-Reaktion wurden 0,5 μM jedes Primers, 2 μl cDNA und 10 μl SYBR Green (Thermo Scientific) verwendet. Die relative fache Änderung der Genexpression wurde mit der 2−ΔΔCT-Methode53 bestimmt. Die anfängliche Denaturierung wurde 5 Minuten lang bei 95 °C durchgeführt, gefolgt von 40 Zyklen, bestehend aus 10 Sekunden langer Denaturierung bei 95 °C, 30 s langem Tempern bei 62 °C und 30 s langer Datenerfassung bei 74 °C. Die amplifizierten Produkte wurden auf einem 1,5 %igen Agarosegel analysiert, um die unspezifische Amplifikation (sofern vorhanden) und Primerdimere zu beurteilen.

Alle Experimente wurden gemäß den Richtlinien der Tierethikkommission des Instituts, ICAR-IVRI, Izatnagar, Indien, und gemäß den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Die bakterielle Belastung in Leber und Milz wurde wie zuvor beschrieben54 beurteilt. Kurz gesagt, eintägige Küken wurden vom ICAR-Central Avian Research Institute (CARI), Izatnagar, Indien, beschafft und mit Futter und Wasser nach Belieben versorgt. Die Vögel wurden auf das Vorhandensein von Salmonella spp. untersucht. Die von Salmonellen befreiten Vögel wurden in zwei Gruppen aufgeteilt und oral mit S. Typhimurium oder dem Stamm Δms infiziert. 7, 14 und 21 Tage nach der Infektion wurden 5 Vögel aus jeder Gruppe getötet. 100 mg der Leber und der gesamten Milz wurden in 1 ml PBS homogenisiert. 100 µl homogenisierte Proben wurden auf HEA-Platten ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert.

Der Oxidationsstatus der Malatsynthase wurde mit dem OxyBlot™ Protein Oxidation Detection Kit (EMD Millipore) bewertet. Malat-Synthase wurde gereinigt und mit 100 mM H2O2 wie zuvor beschrieben9 inkubiert. Überschüssiges H2O2 wurde durch Dialyse entfernt. Unterschiedliche Konzentrationen (2, 1, 0,5 μg) der H2O2-exponierten Malat-Synthase-Proben wurden mit 6 % SDS (Endlösung) denaturiert und mit 2,4-Dinitrophenyhydrazin (DNPH) derivatisiert. Die derivatisierten Proben wurden dann auf 10 % SDS-Gel aufgelöst und auf die Nitrozellulosemembran elektrogeblottet. Nach der Blockierung wurde der Blot in Anti-DNPH-Antikörpern inkubiert und wie in einem an anderer Stelle beschriebenen Protokoll beschrieben55 entwickelt.

S. Typhimurium wurde in M9-Minimalmedium, ergänzt mit Glucose oder Acetat, kultiviert. Die in der späten stationären Phase gewachsenen Kulturen wurden pelletiert und mit eiskaltem PBS gewaschen. Die Pellets wurden dann mit BugBuster Master Mix (EMD Millipore Corp, USA) lysiert und intakte Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt. Die Gesamtproteine ​​in den geklärten Überständen wurden mit dem Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, USA) geschätzt. Fünfzehn Mikrogramm zellfreie Lysate wurden auf SDS-Gel aufgelöst und auf PVDF-Membranen übertragen. Nach der Blockierung wurden die Membranen mit Anti-MS-Hyperimmunseren (1:50.000 Verdünnungen in PBS-Tween 20) inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Membran in mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG (Sigma, bei einer Verdünnung von 1:15.000 in PBS-Tween 20) gewaschen und unter Verwendung von NBT und BCIP als Substrat9 entwickelt.

Die grafische Darstellung der Daten erfolgte mit der Microsoft Excel-Software und die Analyse der Ergebnisse erfolgte durch eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA).

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel [und seinen ergänzenden Informationsdateien] enthalten.

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Diese Arbeit wurde vom Department of Biotechnology, Indien (Grant-Nr.: BT/PR13689/BRB/10/1399/2015) und NASF, ICAR, Indien (Grant-Nr.: NFBSFARA/BS-3012/2012-13) finanziert ). Die Geldgeber haben keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerhebung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts. Wir danken unserem Direktor, ICAR-Indian Veterinary Research Institute (IVRI), für die Bereitstellung der notwendigen Einrichtungen. Ratanti Sarkhel dankt der ICAR und dem Indian Council of Medical Research (ICMR-SRF), Indien, für die Unterstützung.

Abteilung für Biochemie, ICAR-Indian Veterinary Research Institute, Izatnagar, 243122, Indien

Ratanti Sarkhel, Shekhar Apoorva, Swagatika Priyadarsini, Hari Balaji Sridhar, Sanjeev Kumar Bhure und Manish Mahawar

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RS, SA, HBS und SP führten die Experimente durch. RS, SKB und MM führten die Analyse durch und verfassten die Arbeit. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Manish Mahawar.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 11. Januar 2022

Angenommen: 12. September 2022

Veröffentlicht: 25. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20245-0

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