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Dec 11, 2023

Enterische Methanemission von Milchkühen, denen eine Dosis Jodoform zugesetzt wurde

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12797 (2023) Diesen Artikel zitieren 457 Zugriffe 2 Details zu Altmetric Metrics Die enterische Methanemission (CH4) ist eines der wichtigsten Treibhausgase, die entstehen

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12797 (2023) Diesen Artikel zitieren

457 Zugriffe

2 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die enterische Methanemission (CH4) ist eines der wichtigsten Treibhausgase, die von Rindern ausgehen. In Studien wurde festgestellt, dass Iodoform in vitro ein wirksamer Milderer der CH4-Bildung im Pansen ist. Ziel dieser Studie war es, das Potenzial von Iodoform als antimethanogenen Futterzusatzstoff für Milchkühe zu quantifizieren und die Auswirkungen auf die Futteraufnahme, die Milchproduktion, die Futterverdaulichkeit, das Pansenmikrobiom und die Tiergesundheitsindikatoren zu untersuchen. Das Experiment wurde als 4 × 4-Latin-Square-Design mit vier laktierenden Pansen-, Zwölffingerdarm- und Ileumkanülen von dänischen Holstein-Milchkühen durchgeführt. Die Behandlungen bestanden aus vier verschiedenen Dosen Jodoform (1) 0 mg/Tag, (2) 320 mg/Tag, (3) 640 mg/Tag und (4) 800 mg/Tag. Iodoform wurde zweimal täglich intraruminal ergänzt. Jeder Zeitraum bestand aus 7 Tagen Anpassung, 3 Tagen Verdauung und Blutentnahme sowie 4 Tagen Gasaustauschmessungen mithilfe von Beatmungskammern. Milchleistung und Trockenmasseaufnahme (DMI) wurden täglich aufgezeichnet. Für mikrobielle Analysen wurden Pansenproben entnommen und auf Fermentationsparameter untersucht. Es wurde Blut entnommen und auf Stoffwechsel- und Gesundheitszustandsindikatoren analysiert. Mit zunehmender Dosis verringerten sich die Trockenmasseaufnahme und die Milchproduktion linear um maximal 48 % bzw. 33 %. Die Methanausbeute (g CH4/kg DMI) nahm um maximal 66 % ab, während bei der Wasserstoffausbeute (g H2/kg DMI) mit zunehmender Iodoformdosis ein bis zu 125-facher Anstieg beobachtet wurde. Die Gesamtverdaulichkeit von DM, OM, CP, C, NDF und Stärke im Verdauungstrakt wurde durch die Behandlungen nicht beeinträchtigt, es wurden jedoch große Verschiebungen, mit Ausnahme von NDF, bei der Verdauung der Nährstoffe vom Pansen zum Dünndarm beobachtet. Mit zunehmender Dosis wurden einige Anzeichen einer gestörten mikrobiellen Aktivität im Pansen und der Fermentationsdynamik beobachtet, die Gesamtzahl der Pansenbakterien blieb jedoch durch die Behandlung unverändert. Serum- und Plasma-Biomarker zeigten keine negativen Auswirkungen von Jodoform auf die Kuhgesundheit. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Jodoform ein wirksamer Milderer der CH4-Emission war. Allerdings wurden DMI und Milchproduktion negativ beeinflusst und mit Anzeichen einer verminderten Pansengärung in Verbindung gebracht. Zukünftige Studien könnten zeigen, ob eine Verringerung der Milchleistung und der Futteraufnahme vermieden werden kann, wenn Jodoform kontinuierlich verabreicht wird, indem es in eine Gesamtration eingemischt wird.

Methan (CH4) ist eines der wichtigsten Treibhausgase, die von Rindern ausgehen. Das globale Erwärmungspotenzial ist in einer 100-Jahres-Perspektive 28-mal höher als das von Kohlendioxid (CO2). Daher ist der Beitrag von Rindern zu Treibhausgasemissionen und zum Klimawandel erheblich1,2. Methan von Wiederkäuern entsteht hauptsächlich durch mikrobielle Fermentation von Futtermitteln im Pansen. Während dieser Fermentation produzieren Mikroben CO2 und Wasserstoff (H2), die von Archaeen, einer speziellen Domäne von Mikroorganismen, in CH4 umgewandelt werden. Die Methanogenese senkt effizient den Partialdruck im Pansen von Wasserstoff (H2), der dabei als Elektronendonor dient, wobei CO2 und H2 von den methanogenen Archaeen3 in CH4 und H2O umgewandelt werden. Diese kontinuierliche Entfernung unterstützt die Pansengärung, indem die hemmende Wirkung von H2 auf die Mikrobiota beseitigt wird4. Daher kann ein erhöhter H2-Druck im Pansen die Faserverdauung, die Trockenmasseaufnahme (DMI) und die Tierproduktivität negativ beeinflussen5. Unter erheblicher Hemmung der Methanogenese kann auch H2 in erheblichen Mengen ausgeschüttet werden6,7.

In der Vergangenheit wurde gezeigt, dass halogenierte Verbindungen wie Trichlorethyladipat, Trichlorethylpivalat, Bromoform und Chloroform sowohl in In-vitro- als auch In-vivo-Studien wirksame Inhibitoren der CH4-Bildung sind8,9,10. Die antimethanogene Aktivität hängt normalerweise von der Anzahl der Halogene im Molekül ab, wobei jodhaltige Verbindungen am wirksamsten sind, gefolgt von bromierten und chlorierten Analoga11. Der vorgeschlagene Mechanismus beinhaltet die irreversible Reaktion der halogenierten Verbindungen mit reduziertem Vitamin B12, um den Cobamid-abhängigen Methylgruppentransfer zu hemmen und die Funktion von Corrinoidenzymen im Methanogeneseprozess zu blockieren12,13,14. Ein weiterer möglicher Mechanismus ist die kompetitive Hemmung der CH4-Produktion durch die Funktion als konkurrierende terminale Elektronenakzeptoren14,15.

Mitsumori et al.16 fanden heraus, dass Bromchlormethan (CH2BrCl) bei Ziegen zu einer Hemmung der Methanogenese um etwa 80 % führte, was auch mit einem dramatischen Anstieg der H2-Emission verbunden war. Die Ergänzung hatte keine Auswirkungen auf den DMI oder die Nährstoffverdaulichkeit16. Eine ähnliche Hemmung der Methanogenese durch Bromchlormethan wurde in anderen Studien beobachtet17,18. Aufgrund seiner ozonabbauenden Wirkung ist Bromchlormethan jedoch in vielen Ländern von der kommerziellen Nutzung ausgeschlossen14,19. Ein anderes Halomethan, Chloroform (CHCl3), kann die Methanogenese ebenfalls in ähnlichem Maße hemmen wie Bromchlormethan20,21. Aufgrund seiner kurzen Lebensdauer und seines überwiegend natürlichen Ursprungs22 gilt Chloroform normalerweise nicht als ozonschädigend, es gilt jedoch als krebserregender Stoff19,23. Im Gegensatz dazu ist Iodoform (CHI3) ein Halomethan, das weder als ozonschädigend noch krebserregend gilt und für die Verwendung in der Pharmaindustrie ohne obere Toleranzgrenze zugelassen ist, jedoch noch nicht als Futtermittelzusatzstoff zugelassen ist19. Es wurde bereits früher beobachtet, dass Jodoform in vitro ein wirksamer Inhibitor der CH4-Produktion ist8. Es gibt jedoch keine Studien, in denen Jodoform bei der Verfütterung an Milchkühe getestet wurde.

Die Ziele dieses Experiments bestanden darin, das antimethanogene Potenzial von Iodoform zu quantifizieren, wenn es Milchkühen intraruminal in einer Dosis-Wirkungs-Studie pulsiert wird, und die damit verbundenen Auswirkungen auf Futteraufnahme, Milchproduktion, Nährstoffverdaulichkeit, Mikrobiom und Tier zu untersuchen Gesundheitsindikatoren. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass steigende Iodoform-Dosen CH4 linear verringern und gleichzeitig die H2-Emission erhöhen würden, ohne die Futteraufnahme oder die Milchproduktion der Milchkühe zu beeinträchtigen.

Das Experiment wurde an der Universität Aarhus, AU Viborg – Forschungszentrum Foulum, Dänemark, durchgeführt und entsprach den Richtlinien des dänischen Ministeriums für Umwelt und Ernährung in Bezug auf Tierversuche und die Pflege der untersuchten Tiere (Gesetz 474 vom 15. Mai). 2014 und Executive Order 2028 vom 14. Dezember 2020) und unter Berücksichtigung der ARRIVE-Richtlinien. Das Versuchsprotokoll wurde von der dänischen Tierversuchsinspektion genehmigt (Lizenznr. 2018-15-0201-01495). Vier laktierende dänische Holstein-Milchkühe wurden einem von vier Iodoform-Werten (0, 320, 640 oder 800 mg/Tag) gemäß einem 4 × 4-Latin-Square-Design zugeordnet. Jeder der vier Versuchsperioden bestand aus 7 Tagen Anpassung, 3 Tagen Verdauung und Blutentnahme sowie 4 Tagen Gasaustauschmessung. Um der relativ kurzen Anpassungsphase Rechnung zu tragen, wurde den Kühen am 1. und 2. Tag in jedem Zeitraum eine Pansenimpfung mit dem Panseninhalt von zwei nicht experimentellen Kühen mit Kanüle verabreicht, die mit der gleichen Ration wie die experimentellen Kühe gefüttert wurden. Ursprünglich sollte die höchste Jodoformdosis 1080 mg/Tag betragen. Diese Behandlung wurde jedoch nach 11 Tagen in Periode 1 aufgrund eines inakzeptablen Rückgangs der Futteraufnahme abgebrochen. Daher wurde in den verbleibenden Zeiträumen die höchste Dosierung auf 800 mg/Tag reduziert und die ursprünglich der höchsten Dosis zugewiesene Kuh durch eine andere Kuh ersetzt.

Es wurden vier multipare Kühe (zwei 2. Parität und zwei 3. Parität) verwendet, die zuvor mit Pansen-, Zwölffingerdarm- und Ileumkanülen zur Sammlung von Digesta ausgestattet waren. Zu Beginn des Experiments betrug die durchschnittliche ± SD-Milchleistung 33,1 ± 2,10 kg/Tag, die Milchtage 210 ± 66 Tage und das BW 666 ± 60 kg. Die Kühe wurden in Einzelställen (400 × 450 cm) mit Spaltenboden und einer Liegebox mit Matratzen und Sägemehl untergebracht. Die Kühe wurden zweimal täglich um 6.30 und 16.30 Uhr gemolken.

Eine Teilmischration (PMR) wurde einmal täglich morgens zubereitet und den Kühen ad libitum in zwei täglichen Mahlzeiten um 7.15 und 17.15 Uhr mit 3–5 kg Futterresten pro Kuh und Tag mit ca. 40 % Futter verabreicht. der Tagesration am Morgen und 60 % am Nachmittag. Futterreste wurden täglich vor der Morgenfütterung gewogen. Die Ration wurde gemäß dem NorFor-Futterbewertungssystem24 für dänische Holstein-Milchkühe mit einer jährlichen ECM-Produktion von 11.700 kg zusammengestellt. Als Raufutter und Sojamehl, Zuckerrübenschnitzel, Rapskuchen wurden Maissilage und sowohl Frühlingswachstums- als auch erste Nachwuchsgras-/Klee-Silage (Dauerweidelgras, Hybrid-Weidelgras, Rotklee und Weißklee) aus denselben Silobunkern während des gesamten Experiments einbezogen. Gerste und Mineralstoffzusätze waren als Konzentrate enthalten (Tabelle 1). Die Hälfte der Tagesdosis Jodoform, gelöst in 20 ml 99 %igem Ethanol und gemischt mit 500 g ± 1 g Konzentrat (KomKalv, DLG amba, Dänemark), wurde intraruminal verabreicht, indem es während des Melkens manuell in den Panseninhalt eingemischt wurde 06:30 und 16:30 Uhr. Da eine feste Menge Konzentrat verwendet wurde, um vor der Dosierung eine ordnungsgemäße Einmischung von Jodoform in das Konzentrat sicherzustellen, hing der Raufutteranteil am gesamten DMI von der PMR-Aufnahme der einzelnen Kuh ab. Der Nährstofffluss im Verdauungstrakt wurde anhand der externen Marker Chrom(III)oxid (Cr2O3) und Titandioxid (TiO2) bestimmt. Diese wurden in abbaubaren Papierbeuteln (10,0 g Cr2O3 und 13,0 g TiO2) abgewogen und zweimal täglich zeitgleich mit der Verabreichung von Jodoform direkt in den Pansen dosiert. Die Kühe hatten freien Zugang zu Wasser und die aufgenommene Wassermenge wurde während der Kammerperiode mit einem Wasserzähler (Brødrene Dahl, Brøndby, Dänemark) gemessen.

Am 1. und 2. Tag jedes Versuchszeitraums wurden die Kühe um 06:45 Uhr mit Panseninhalt von zwei nicht experimentell kanülierten Kühen geimpft, die mit der gleichen Ration wie die Versuchskühe gefüttert wurden. Dies geschah, um mögliche Übertragungseffekte auf die Pansenmikrobiota aufgrund von Behandlungen im vorangegangenen Zeitraum zu minimieren. Der Panseninhalt (insgesamt 12 kg, davon 6 kg von jeder nicht-experimentellen Kuh) wurde jeder experimentellen Kuh durch die Pansenkanüle zugeführt und mit der oberen Schicht des Panseninhalts vermischt.

In jedem Zeitraum wurden Pansenflüssigkeit, Zwölffingerdarm- und Ileuminhalt, Urin und Kot über 8 Probenahmezeiten an 3 Tagen gesammelt (um 9.00 und 18.00 Uhr am Tag 8; um 03.00, 12.00 und 21.00 Uhr am Tag 9; und 06.00, 15.00 Uhr). und 00.00 Uhr am Tag 10), um jede dritte Stunde eines 24-Stunden-Tages abzudecken. Während des Probenahmezeitraums wurden 8 Proben aus dem Zwölffingerdarm (0,5 l) und dem Ileum (0,2 l) in an den Kanülen befestigten Plastiktüten gesammelt. Stuhlproben (0,35 l) wurden während des freiwilligen Stuhlgangs oder durch Stichprobenentnahme aus dem Rektum entnommen. Digesta-Proben wurden über alle Probenahmezeiten hinweg gepoolt und bis zur Analyse bei –20 °C gelagert.

Pansenflüssigkeit (30 ml) wurde mit einer 50-ml-Spritze, die an einem 90-cm-Stahlpansenprobenehmergerät (Bar Diamond Inc., Parma, Idaho, USA) befestigt war, aus dem ventralen Pansensack entnommen. Unmittelbar nach der Probenahme wurde der pH-Wert in der Pansenflüssigkeit mit einem digitalen pH-Meter (Meterlab PHM 220, Radiometer, Brønshøj, Dänemark) gemessen. Die Proben wurden zur späteren Analyse der Konzentration flüchtiger Fettsäuren (VFA), L-Lactat, Glucose und Ammoniak (NH3) bei –20 °C gelagert. Gleichzeitig mit der Entnahme der Pansenflüssigkeit wurde das Redoxpotential im dorsalen Pansen mit einem Redoxmessgerät mit Platinelektrode (Intellical MTC101 ORP/Redox-Elektrode, Hach, Deutschland) gemessen. Die Elektrode wurde 10 cm unter der Oberfläche der Pansenmatte in den Panseninhalt eingeführt und das Redoxpotential wurde nach 2 Minuten Stabilisierung aufgezeichnet. Der Urin wurde zu allen Probenahmezeitpunkten beim freiwilligen Wasserlassen oder bei manueller Stimulation der Beckenregion gesammelt. Der pH-Wert wurde unmittelbar nach der Entnahme mit demselben digitalen pH-Meter gemessen und die Proben wurden bei –20 °C gelagert, bis sie auf ihren Kreatiningehalt analysiert wurden.

Am 8. Tag um 8.00 Uhr und am 10. Tag um 14.00 Uhr wurde durch Venenpunktion Blut aus der Schwanzvene entnommen und in Na-Heparin-Vakutainern (Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Österreich) zur anschließenden Bestimmung von Thyroxin (T4) gesammelt. Die Röhrchen wurden 20 Minuten lang bei 4 °C und 3000×gav zentrifugiert. Zusätzlich wurde Blut in Serum-Vakutainer (Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Österreich) zur Bestimmung von Harnstoff, Glucose, β-OH-Butyrat (BHB), nicht veresterten Fettsäuren (NEFA), Gallensäure und Gesamtprotein entnommen. Albumin, Aspartataminotransferase (AST), Gamma-Glutamyltransferase (g-GT), Glutamatdehydrogenase (GLDH) und Gesamtbilirubin. Die Proben wurden mindestens 1 Stunde lang bei Raumtemperatur koagulieren gelassen, bevor sie 10 Minuten lang bei 1300 × gav und 20 °C zentrifugiert wurden. Plasma- und Serumproben wurden in Kryoröhrchen überführt und bis zur Analyse bei –20 °C gelagert.

Die Milchleistung wurde während des gesamten Experiments täglich aufgezeichnet. Die Zusammensetzung der Milch wurde am 12. und 13. Tag bestimmt. Die Trockenmasseaufnahme der Kühe wurde vom 8. bis 14. Tag täglich durch Wiegen der Menge des zugewiesenen Futters und der Futterreste gemessen, gefolgt von der Bestimmung des TS-Gehalts des Futters und der Rückstände Die Futteraufnahme wurde während des gesamten Experiments aufgezeichnet. Die Nährstoffzusammensetzung des TMR wurde während des Probenahmezeitraums bestimmt, indem die Proben von jedem Tag über den Zeitraum hinweg gepoolt wurden.

Der Gasaustausch wurde am Tag 11–14 unter Verwendung von vier einzelnen transparenten Atmungskammern aus Polycarbonat basierend auf der indirekten Kalorimetrie im offenen Kreislauf gemessen, modifiziert von ALF Hellwing et al.25. Die Kammern wurden quadratisch in einem separaten Stall platziert, um Sichtkontakt zwischen den Kühen zu ermöglichen. Die Innenabmessungen der Kammern betrugen 415 (Länge) × 270 (Breite) × 234 cm (Höhe), was einem Volumen von 28,4 m3 entspricht. Der Luftstrom wurde mit einem Massendurchflussmesser (HFM-200 mit Laminarströmungselement, Teledyne Hastings Instruments, Hampton, Virginia, USA) gemessen. Die Konzentrationen der Gase (CH4, CO2, O2 und H2; Columbus Instruments, Columbus, Ohio, USA) in der Abluft sowie Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Druck (Veng Systems, Roslev, Dänemark) in den Kammern wurden ebenfalls gemessen. Vor, während und nach den Experimenten wurden Rückgewinnungstests (n = 40 für CO2 und n = 21 für CH4) durchgeführt, indem eine bekannte Menge reines CO2 oder CH4 in die Kammern infundiert und mit der vom System gemessenen Gasmenge verglichen wurde . In allen Kammern betrugen die durchschnittlichen Wiederfindungswerte ± SD 99,5 ± 1,45 % für CO2 und 100,3 ± 2,37 % für CH4. Zur Korrektur der gemessenen Gaskonzentrationen wurden Wiederherstellungstests eingesetzt. Der Durchschnitt der CH4- und CO2-Rückgewinnung wurde zur Korrektur von O2 und H2 verwendet. Während des gesamten Experiments wurden die Kühe für die ersten 48 Stunden der Gasmessungen derselben spezifischen Atemkammer zugewiesen. Für die letzten 48 Stunden der Gasmessung wurden die Kühe entlang der Diagonale in die Kammer verlegt, um eventuellen Unterschieden in der Hintergrundluftzusammensetzung entgegenzuwirken.

Panseninhaltsproben für Mikrobiomanalysen wurden am 9. Tag um 14.00 Uhr entnommen. Vier Stichproben aus dem dorsalen, ventralen, kranialen und kaudalen Pansen wurden durch die Pansenkanüle entnommen und gemischt. Ungefähr 50 g gemischter Panseninhalt wurden sofort bei −80 °C eingefroren und anschließend gefriergetrocknet und in einer sauberen Kaffeemühle fein gemahlen, um die Homogenität der Probe sicherzustellen. Das Gewicht der nassen und getrockneten Proben wurde aufgezeichnet und die getrockneten Proben bis zur Analyse bei –20 °C gelagert. DNA wurde aus ca. 15 mg getrockneter Pansenprobe (tatsächliches Gewicht aufgezeichnet) mit dem NucleoSpin DNA-Stuhl-Kit (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) extrahiert, wobei die Anweisungen des Herstellers befolgt und in 150 µL Elutionspuffer eluiert wurden. In die DNA-Extraktion wurde eine Negativkontrolle von Wasser einbezogen. Die DNA-Konzentration wurde mit dem Qubit Broad Range Kit (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) bestimmt.

Gesamtbakterien und Archaeen sowie spezifische Archaeengruppen wurden mit qPCR unter Verwendung der in Tabelle 2 beschriebenen Primer (Sigma-Aldrich) quantifiziert. Primersequenz, Annealing-Temperatur und Standard-DNA für jedes Primerpaar sind in Tabelle 2 aufgeführt. Jede Reaktion enthielt 5 µL RealQ Plus 2× Master Mix, grün (niedriger ROX) (Amplicon III, Dänemark), Primer in Endkonzentrationen von 0,3 µM, 2 µL Template-DNA und nukleasefreies Wasser bis zum Endvolumen von 10 µL. Die qPCR-Analyse wurde mit einer MicroAmp Optical 384-Well-Reaktionsplatte (Applied Biosystems) und einem ABI ViiA7 Echtzeit-PCR-System (Thermo Fisher Scientific) unter den folgenden Laufbedingungen durchgeführt: Vorbehandlung von 2 Minuten bei 50 °C, gefolgt von anfänglicher Denaturierung (15 Minuten bei 95 °C) und anschließend 40 Denaturierungszyklen für 15 Sekunden bei 95 °C, Glühen für 30 Sekunden bei der in Tabelle 2 aufgeführten Temperatur und 30 Sekunden bei 72 °C zur Basisverlängerung. Schmelzkurven wurden abgeleitet, indem die Temperatur von 60 auf 95 °C mit einer Geschwindigkeit von 0,05 °C/s erhöht und kontinuierlich aufgezeichnet wurde. Alle Reaktionen wurden dreifach durchgeführt und in jedem Lauf war eine Kontrolle ohne Vorlage enthalten. Die Genkopien in den Proben wurden anhand einer Standardkurve fünffach seriell verdünnter Standard-DNA mit bekannter Kopienzahl berechnet und als Kopien pro g Panseninhalt (Feuchtgewicht) ausgedrückt. Die Standardkopienzahl wurde aus der DNA-Konzentration, der Anzahl der Zielkopien pro Genom und der Genomgröße26 berechnet.

Amplikonbibliotheken, die die V3–V4-Region des 16S-rRNA-Gens abdecken, wurden gemäß Noel et al.31 unter Verwendung der von Klindworth et al.32 empfohlenen Universalprimer Bac341F und Bac805R erstellt. Amplikonbibliotheken wurden auf der Illumina MiSeq-Plattform (Illumina, San Diego, CA, USA) am gepaarten Ende sequenziert (2 × 300 bp). Rohe Mikrobiom-Sequenzablesungen wurden in der NCBI-Short-Read-Archivdatenbank unter der BioProject-ID: PRJNA906944 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA906944) hinterlegt. Demultiplexte Sequenzlesevorgänge wurden mit QIIME2 v2022.233 verarbeitet. Kurz gesagt: Primer wurden durch Basentrimmen entfernt, Rohdaten wurden qualitätsgefiltert, entrauscht und zusammengeführt, PCR-Chimären wurden entfernt und Amplikonsequenzvarianten (ASV) wurden unter Verwendung des DADA2 v2022.2-Plugins34 unter Anwendung der folgenden Parameter abgeleitet: Trimmen auf der linken Seite bei Basis 17 für Vorwärts- und an Basis 21 für Rückwärts-Lesevorgänge (Entfernung des Primers), Abschneiden des rechten Lesevorgangs an Basis 280 für Vorwärts- und an Basis 262 für Rückwärts-Lesevorgänge (Entfernung von Basen schlechter Qualität) und ansonsten Standardparametereinstellungen. Insgesamt wurden 5870 ASVs entdeckt. ASVs wurden taxonomisch mithilfe eines 16S V3–V4-spezifischen Naive Bayes-Klassifikators zugewiesen, der auf geclusterten 16S-rRNA-Gensequenzen mit einer Ähnlichkeit von 99 % trainiert wurde, die aus der SILVA v138-Referenzdatenbank extrahiert und so zugeschnitten wurden, dass sie die durch das Primerpaar Bac341F und Bac805R gebundene V3–V4-Region abdecken. Die im gesamten Artikel verwendete mikrobielle Taxonomie der Pansenmikrobiota stimmt mit der Taxonomie überein, die in der Datenbank SILVA v138 angegeben ist. Für phylogenetische Schlussfolgerungen wurden ASVs mit Mafft v7.31035 abgeglichen, stark variable Positionen wurden maskiert, ein unbewurzelter phylogenetischer Baum wurde mit FastTree v2.1.1036 erstellt und in der Mitte des längsten Abstands von Spitze zu Spitze verwurzelt.

Der Trockensubstanzgehalt von frischen Futter- und Rückstandsproben wurde durch tägliches Trocknen bei 60 °C für 48 Stunden37 bestimmt. Futter- und Digestaproben wurden vor der chemischen Analyse gefriergetrocknet und auf einem 1-mm-Sieb gemahlen, mit Ausnahme eines 0,5-mm-Siebes, das für die Stärkeanalyse verwendet wurde (Ultra Centrifugal Mill ZM 200, Verder Scientific, Hann, Deutschland). Der Aschegehalt wurde durch 6-stündige Verbrennung bei 525 °C bestimmt. Der Gehalt an N und C in Futter- und Digestaproben wurde mit einem Vario Macrocube-Elementaranalysator (Elementar, Langenselbold, Deutschland) bestimmt. Rohprotein wurde als Stickstoff × 6,25 berechnet. Rohfett wurde durch Soxhlet-Extraktion mit Petrolether (Soxtec 2050, Foss Analytical, Hillerød, Dänemark) nach Hydrolyse mit HCl38 bestimmt. Die Konzentrationen an neutralen Detergensfasern (aNDFom), sauren Detergensfasern (ADF) und sauren Detergensligninen (ADL) im PMR- und Konzentratgemisch wurden nacheinander gemäß den ANKOM-Verfahren39 in einem ANKOM2000-Faseranalysator (ANKOM Technology, Macedon, New York, USA) bestimmt. USA) unter Verwendung von hitzestabiler α-Amylase und Natriumsulfit40. aNDFom in Verdauungsproben und Fäkalien wurde ebenfalls mit hitzestabiler α-Amylase und Natriumsulfit im ANKOM2000 Fiber Analyzer bestimmt und als aschefreier NDF angegeben. Stärke wurde mit hitzestabiler α-Amylase und Amyloglucosidase verdaut und die Reaktion anschließend mit einem YSI-Modell 2900-Analysegerät (YSI Inc., Yellow Springs, OH) auf Glucose41 untersucht. Der TiO2-Gehalt in Verdauungs- und Kotproben wurde nach Myers et al.42 analysiert, während der Cr2O3-Gehalt in Verdauungs- und Kotproben durch Oxidation zu Chromat analysiert und anschließend spektrophotometrisch unter Verwendung eines Lamba 900-Geräts (PerkinElmer Inc., Waltham, Massachusetts, USA43) bestimmt wurde ).

Die VFA-Konzentrationen wurden in stabilisierter Pansenflüssigkeit nach Methanol-Chloroform-Extraktion mit 2-Ethylbutyrat als internem Standard unter Verwendung eines GC (Trace 1310, Thermo Scientific, Deutschland) mit Split/Splitless-Injektor bei 225 °C und eines Flammenionisationsdetektors bei 250 °C bestimmt °C. Eine 30 m × 0,53 mm × 1 µm große HP-FFAP-Säule (Agilent Technologies Inc., Wilmington, DE) wurde mit Helium als Trägergas bei 0,3405 atm verwendet. Der GC-Ofen wurde so programmiert, dass er mit 10 °C/min von 100 auf 200 °C ansteigt. Die NH3-Konzentration in der Pansenflüssigkeit wurde mit dem Randox Ammonia Kit-AM1015 und Cobas Mira Plus (Roche) nach Verdünnung mit Phosphatpuffer (100 mmol/l) gemessen. L-Lactat und Glucose wurden mit der Technik der immobilisierten Glucoseoxidase-Elektrode44 (YSI 2900D, YSI Inc., Yellow Springs, USA) analysiert.

Das Kreatinin im Urin wurde nach Standardverfahren bestimmt (Siemens Diagnostics® Clinical Methods for ADVIA 1800® Chemistry System; Siemens Medical Solutions, Tarrytown, New York, USA). Milchproben wurden mittels Reflexion im mittleren Infrarotbereich (MilkoScan™ 7 RM; Eurofins Steins Laboratorium A/S, Vejen, Dänemark) auf den Gehalt an Fett, Protein, Laktose-Monohydrat, Harnstoff und die Zusammensetzung der Fettsäuren45 analysiert.

Die Konzentrationen von Glucose, L-Lactat und Harnstoff im Serum wurden durch einen spektrophotometrischen Test gemäß den Richtlinien des Herstellers (Siemens Medical Solutions, Tarrytown, New York, USA) gemessen. Nicht veresterte Fettsäuren wurden mit der Wako, NEFA C ACS-ACOD-Testmethode bestimmt. β-OH-Butyrat wurde mithilfe einer Methode bestimmt, bei der Oxamsäure im Medium zur Hemmung der Laktatdehydrogenase eingesetzt wurde, gefolgt von der Messung der Absorption bei 340 nm aufgrund der Produktion von NADH46. Alle Analysen wurden mit einem automatischen Analysegerät, ADVIA 1800 ®Chemistry System (Siemens Medical Solutions, Tarrytown, New York, USA), durchgeführt. Thyroxin im Plasma wurde im Zentralen Veterinärlabor der Universität Kopenhagen, Dänemark, analysiert und mit dem Immunoassay-System Immulite® 2000 (Immulite 2000, Siemens Healthineers, Erlangen, Deutschland) gemessen. Gallensäure, Gesamtprotein, Albumin, AST, g-GT, GLDH und Gesamtbilirubin wurden im Serum von Laboklin Laboratory for Clinical Diagnostics GmbH & Co. KG (Bad Kissingen, Deutschland) unter Verwendung der photometrischen Methode auf einem Roche Cobas® 8000 analysiert (Roche Diagnostics, Indianapolis, USA).

Die Gesamttrockenmasseaufnahme wurde auf der Grundlage der Menge an aufgenommenem PMR und der Konzentratmischung berechnet, die zur interruminalen Jodoformergänzung verwendet wurde. Die Gesamtwasseraufnahme wurde als Summe der gemessenen aufgenommenen Wassermenge und der Wasseraufnahme aus PMR und Konzentrat berechnet. Das mit den Fäkalien ausgeschiedene Wasser wurde als Differenz zwischen dem Gesamtfäkalienfluss und dem DM-Fluss gemessen. Die geschätzte Wasserausscheidung in der Milch wurde als kg Milch berechnet, von der der Fett-, Protein- und Laktosegehalt abgezogen wurde, wobei ein angenommener ähnlicher Mineralstoffgehalt zwischen den Behandlungen außer Acht gelassen wurde, während die geschätzte Wasserausscheidung im Urin als Gesamtaufnahme abzüglich des im Kot ausgeschiedenen Wassers berechnet wurde und geschätzte Ausscheidung in der Milch, wobei eine angenommene ähnliche und angenommene unbedeutende Wasserverdunstung der Tiere außer Acht gelassen wurde.

Der Bruttoenergiegehalt in PMR und Konzentrat wurde nach NorFor24 berechnet. Die Milchleistung wurde laut Sjaunja et al.47 in ECM (3,140 MJ/kg) umgerechnet:

mit ECM und Milchleistung in Kilogramm; Fett, Protein und Laktosemonohydrat in Gramm pro Kilogramm. Der Gesamtfettsäuregehalt in der Milch wurde nach Schwarz et al.45 als Fett-% × 0,95 berechnet. Der Atmungskoeffizient (RQ) wurde als Verhältnis zwischen produziertem CO2 und verbrauchtem Sauerstoff (L/L) berechnet. Die Energiebilanz wurde als Differenz zwischen der Nettoenergieaufnahme (MJ/Tag) und der Energieausscheidung in der Milch (MJ/Tag) berechnet.

Zwölffingerdarm-, Ileum- und fäkale DM-Flüsse wurden über Marker hinweg gemittelt, wobei davon ausgegangen wurde, dass die Konzentrationen in gepoolten Digesta-Proben repräsentativ für den durchschnittlichen täglichen Digesta-Fluss waren. Die Flüsse von OM, NDF, Rohprotein (CP), Kohlenstoff (C) und Stärke im Zwölffingerdarm, Ileum und Dickdarm wurden aus dem DM-Fluss und ihren jeweiligen Konzentrationen in jedem Abschnitt des Verdauungstrakts berechnet. Die Aufnahme und der Fluss von DM, OM, NDF, CP, C und Stärke im Zwölffingerdarm, Ileum und im Kot wurden verwendet, um die scheinbare Verdaulichkeit der Nährstoffe in den verschiedenen Abschnitten des Magen-Darm-Trakts zu berechnen. Das Redoxpotential wurde im Vergleich zu einer Standard-Wasserstoffelektrode nicht umgewandelt.

Der Gasaustausch wurde als Durchfluss bei Standardtemperatur und -druck (STP (0 °C (273,15 K) und 101,325 kPa)) gemessen. Die berechnete Produktion oder Verwendung von Gasen in L/Tag wurde unter Verwendung der Dichte jedes Gases bei STP, die 0,716, 1,963, 0,0899 und 1,428 (L/g) für CH4, CO2, H2 und O2 betrug, in g/Tag umgerechnet. jeweils. Die stündlichen Emissionen wurden als Summe des innerhalb einer Stunde produzierten Gases berechnet. Die Gasemissionen während einer Stundenschicht wurden nach Zeitanteil in den jeweiligen Stundenstunden aufgeteilt. Die Daten wurden gelöscht, wenn die Kammern geöffnet waren und die Kühe gemolken und gefüttert wurden. Darüber hinaus wurde angenommen, dass die Kühe in den gelöschten Minuten eine ähnliche Gasproduktion hatten wie der Durchschnitt aller Minuten für jeden Messzeitraum.

Die Beobachtungen aller Variablen wurden innerhalb der Kuh und des Zeitraums gemittelt. Insgesamt gab es 15 Beobachtungen, da die Kuh, der 1080 mg/Tag Jodoform verabreicht wurde, in den verwendeten Daten nicht berücksichtigt wurde.

Statistische Analysen wurden in R 4.1.2 durchgeführt (R Core Team, 2021). Die Wirkung der Behandlung auf die verschiedenen Tierreaktionen wurde mit dem folgenden linearen gemischten Modell analysiert, das mit REML und der „lmer“-Funktion aus dem „lme4“-Paket48 ausgestattet war:

Dabei ist Ytpc die abhängige Antwortvariable, μ der Gesamtmittelwert, α der feste Effekt der Behandlung (t = 0 mg/Tag, 320 mg/Tag, 640 mg/Tag oder 800 mg/Tag) und γ der feste Effekt der Periode (p = 1 bis 4), A ist der zufällige Effekt der Kuh (c = 1 bis 4) und ɛtpc ist der zufällige Restfehler, der als unabhängig mit konstanter Varianz und normalverteilt angenommen wird. Die Daten wurden auf Normalität der Residuen getestet, indem die in R erstellten QQ-Diagramme ausgewertet und der Shapiro-Wilk-Test verwendet wurden. Die Homogenität der Varianz wurde durch Auswertung von Residuendiagrammen und Verwendung des Bartlett-Tests getestet. Die Daten werden in Tabellen als geschätzter Randmittelwert (EMS) und Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. Sie wurden mit dem Paket „emmeans“ abgerufen.

Die stündlichen CH4- und H2-Emissionen wurden mit dem folgenden Modell analysiert:

wobei Ythpc die abhängige Antwortvariable ist, μ der Gesamtmittelwert ist, α die Wirkung der Behandlung ist (t = 0, 320, 640 oder 800 Iodoform/kg TS), τ die feste Wirkung der Stunde ist (h = 0 bis 23), αt × τh ist die Wechselwirkung, γ ist der Periodeneffekt (p = 1-4 · 3), A ist der Kuheffekt (c = 1 bis 4) und ɛthpc ist der zufällige Restfehler, der als unabhängig mit konstanter Varianz angenommen wird und normalverteilt. Die Daten wurden mithilfe einer autoregressiven Kovarianzstruktur erster Ordnung mit heterogener Varianz (AR1) analysiert.

Um die linearen und quadratischen Effekte der Behandlung zu testen, wurde das folgende Modell angewendet:

Dabei sind Dtpc die durch Behandlung, Periode und Kuh bestimmten Dosen, β der quadratische Effekt und der lineare Effekt durch den Parameter α im Modell gegeben, wobei β auf Null gesetzt ist. Die Signifikanz dieser Effekte wurde mit einem F-Test basierend auf der Kenward-Roger-Näherung aus dem Paket „pbkrtest“ getestet.

Zur Berechnung der P-Werte für die festen Effekte wurde eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) verwendet. Unterschiede zwischen EMS wurden zum Vergleich mithilfe der Tukey-Methode bewertet. Statistische Signifikanz wurde angegeben, wenn P ≤ 0,05 und statistische Tendenzen wurden angegeben, wenn 0,05 < P ≤ 0,10.

Die Merkmalstabelle, die Beispieldaten, der Baum und die taxonomischen Klassifizierungen wurden für nachfolgende mikrobielle Datenanalysen als Phyloseq-Objekt49 in R importiert. Sofern nicht anders angegeben, wurden nachfolgende Analysen anhand prävalenzgefilterter, bereinigter und verdünnter ASV-Daten durchgeführt.

Die 10 am häufigsten vorkommenden Bakterienfamilien in allen Proben und gruppiert nach Iodoform-Behandlung wurden mithilfe des ampvis2-Pakets v2.7.1150 identifiziert und als Heatmaps visualisiert. Alpha-Diversitätsmetriken (beobachteter Reichtum, Shannons Diversitätsindex und Faiths phylogenetischer Diversitätsindex) wurden mit Phyloseq berechnet und Unterschiede in der Alpha-Diversität zwischen Behandlungsgruppen wurden mithilfe eines Kruskal-Wallis-Rangsummentests getestet. Unterschiede in der Beta-Diversität und der Zusammensetzung der Pansenmikrobiota wurden mit dem veganen v2.5-7-Paket51 untersucht. Kurz gesagt, die Bray-Curtis-Unähnlichkeitsabstände wurden mit Phyloseq geschätzt. Die Homogenität der Gruppenstreuungen (Varianz) wurde mithilfe der Betadisper-Funktion in Vegan analysiert, Unterschiede in der mikrobiellen Zusammensetzung zwischen Behandlungsgruppen wurden durch Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) auf Bray-Curtis-Unterschiede untersucht und Gruppensignifikanten wurden durch permutationelle multivariate Varianzanalyse (PERMANOVA) berechnet ) Anwendung der Adonis-Funktion mit 9999 Permutationen und ansonsten Standardeinstellungen. PCoA-Ordinationsdiagramme wurden mit dem ggplot2-Paket v3.3.552 erstellt. Die mikrobiellen Zusammensetzungen wurden bei P ≤ 0,05 als signifikant unterschiedlich angesehen. Differenziell häufig vorkommende ASVs wurden mithilfe eines negativen binomialen verallgemeinerten linearen Modellansatzes identifiziert, der im DESeq2-Paket v1.3.453 implementiert ist, wobei beschnittene und prävalenzgefilterte (nicht verdünnte) ASV-Zählungen in mindestens 10 % der Proben vorhanden waren und auf Gattungsniveau und Antwortvariable reduziert wurden Jodoform-Behandlung als fester Effekt. Kurz gesagt, die ASV-Zahlen wurden durch varianzstabilisierende Transformation normalisiert, die Größenfaktoren für jeden ASV wurden unter Verwendung einer Median-Ratio-Methode geschätzt, Streuungen der ASV-Zahlen wurden berechnet und ein negativer binomialer WaldTest wurde durchgeführt53. Paarweise Vergleiche wurden für 320 vs. 0, 640 vs. 0 und 800 vs. 0 berechnet. Die P-Werte wurden mit dem Benjamini-Hochberg-Verfahren angepasst54 und ASVs wurden als unterschiedlich häufig angesehen, wenn FDR ≤ 0,05 und log2-fache Änderungen ≥ 2 oder ≤ − 2.

Das Experiment entsprach den Richtlinien des dänischen Ministeriums für Umwelt und Ernährung in Bezug auf Tierversuche und die Pflege der untersuchten Tiere (Gesetz Nr. 2028, 2020).

Die Trockenmasseaufnahme nahm linear mit zunehmender Jodoformdosis ab. Der Rückgang betrug etwa 32 % bzw. 48 % bei 640 bzw. 800 mg/Tag im Vergleich zu 0 mg/Tag (Tabelle 3). Aufgrund der reduzierenden Wirkung auf den DMI schwankte der Raufutteranteil am gesamten DMI zwischen den Behandlungen geringfügig. Daher lagen die Ballaststoffanteile zwischen 50,7–51,2, 50,0–51,3, 48,0–50,7 und 47,4–50,1 % für 0, 320, 640 bzw. 800 mg/Tag. In ähnlicher Weise wurde eine lineare Abnahme der Milchleistung und der täglichen Mengen an produzierter Laktose, Milchfett und Milchprotein mit zunehmender Jodoformdosis beobachtet; Allerdings war der Rückgang der Milchleistung (ECM) weniger ausgeprägt (15 bzw. 33 % bei 640 bzw. 800 mg/Tag im Vergleich zu 0 mg/Tag) als der Rückgang des DMI. Mit steigender Iodoform-Dosis wurde ein linearer Anstieg des Fettanteils und eine Abnahme des Proteinanteils beobachtet. Mit zunehmender Jodoformdosis wurde auch ein Rückgang des Anteils mittelkettiger Fettsäuren (MCFA), aber auch ein höherer Anteil langkettiger Fettsäuren (LCFA) an den Gesamtfettsäuren (FA) und einfach ungesättigten FA auf Kosten gesättigter FA festgestellt .

Die tägliche CH4-Emission nahm linear mit zunehmender Jodoformdosis von 423 g/Tag bei 0 mg/Tag auf 94,9 g/Tag bei 800 mg/Tag ab. Dieser Rückgang ging mit einem dramatischen Anstieg der H2-Emissionen einher (Tabelle 4). Die Methanausbeute, ausgedrückt in g CH4/kg DMI, nahm mit zunehmender Jodoformdosis ab. Daher sank die CH4-Ausbeute bei einer Jodoform-Supplementierung von 640 bzw. 800 mg/Tag im Vergleich zu 0 mg/Tag um 40 bzw. 66 % (Abb. 1a). Gleichzeitig erhöhte sich die H2-Ausbeute (g H2/kg DMI) um das 125-fache (Abb. 1b) bei 800 mg/Tag im Vergleich zu 0 mg/Tag. Ein ähnliches Muster wurde für die CH4-Intensität (g CH4/kg ECM) und die H2-Intensität (g H2/kg ECM) beobachtet. Die Methanintensität verringerte sich bei 800 mg/Tag um 73 % im Vergleich zu 0 mg/Tag, während die H2-Intensität um das 88-fache anstieg. Zwischen den Behandlungen gab es erhebliche tageszeitliche Schwankungen der Emissionen. Unmittelbar nach der Fütterung stieg die CH4-Emission bei Kühen an, denen 0 mg/Tag zugesetzt wurden, wohingegen die intraruminale Gabe von Iodoform direkt nach der Fütterung zu einer Senkung der CH4-Emission führte (Abb. 2).

(a) Geschätzter Grenzmittelwert der Methan (CH4)-Ausbeute (g CH4/kg Trockenmasseaufnahme (DMI)), Behandlungs-P < 0,01; lineares P < 0,01; quadratisches P ≤ 0,01 und Intensität (g CH4/kg energiekorrigierte Milch (ECM)), Behandlungs-P < 0,01; lineares P < 0,001; quadratisches P = 0,03 (b) und Wasserstoff (H2)-Ausbeute (g H2/kg DMI), Behandlungs-P < 0,01; lineares P < 0,01; quadratisches P = 0,06 und Intensität (g H2/kg ECM), Behandlungs-P < 0,01; lineares P < 0,001; quadratisches P = 0,05 von Milchkühen, denen vier verschiedene Mengen an Jodoform (0, 320, 640 und 800 mg/Tag) intraruminal zweimal täglich (6:30 Uhr und 16:30 Uhr) verabreicht wurden.

Geschätzter marginaler Mittelwert der stündlichen Methan (CH4)-Emission von Milchkühen, denen zweimal täglich intraruminal Jodoform zugesetzt wurde. Gepunktete vertikale Linien zeigen den Zeitpunkt der Iodoform-Dosierung an. Jeder Zeitpunkt stellt die durchschnittliche Methanproduktion für 1 Stunde vor und nach diesem Zeitpunkt dar (d. h. der Zeitpunkt 06:30 Uhr stellt die durchschnittliche Gasproduktion von 06:00 bis 07:00 Uhr dar). Unterhalb der Abbildung unterscheiden sich verschiedene Buchstaben für verschiedene Behandlungen zum gleichen Zeitpunkt deutlich bei P < 0,05.

Die Behandlung wurde am 11. Tag in Periode 1 für die Kuh, die zunächst eine Ergänzungsdosis von 1080 mg/Tag Jodoform erhielt, aufgrund einer starken DMI-Senkung abgebrochen. Nach Beendigung der Behandlung begannen DMI und gasförmige Emissionen auf das Niveau vor der Behandlung zurückzukehren. Nach 3 Tagen hatte sich der DMI verdoppelt und die tägliche Produktion von CH4 stieg um den Faktor 22 (Ergänzungstabelle 1).

Die Gesamtwasseraufnahme nahm linear mit zunehmender Jodoformdosis und niedrigerem DMI ab (Ergänzungstabelle 2). Mit zunehmender Jodoform-Dosis wurde auch ein linearer Anstieg des Anteils der über die Milch ausgeschiedenen Wasseraufnahme festgestellt, während keine Auswirkungen auf den Anteil der über Kot und Urin ausgeschiedenen Mengen festgestellt wurden.

Im Pansen wurde mit steigender Iodoform-Dosis eine lineare Abnahme der Verdaulichkeit von DM, OM, C und CP beobachtet (Tabelle 5). Es wurde auch eine Tendenz zu einer verminderten Pansenverdaulichkeit von Stärke festgestellt, während die Verdaulichkeit von NDF durch die Behandlungen nicht beeinträchtigt wurde. Im Gegensatz dazu kam es jedoch zu einem kompensatorischen Anstieg der Verdaulichkeit im Dünndarm für DM, OM, C und CP mit zunehmender Iodoform-Dosis, und daher wurde die Verdaulichkeit des gesamten Trakts durch die Iodoform-Supplementierung nicht beeinträchtigt, da die Iodoform-Supplementierung keinen Einfluss auf den Dickdarm hatte Verdaulichkeit der Darmnährstoffe.

Mit zunehmender Iodoform-Dosis wurden eine Behandlung und linear abnehmende Effekte auf die Pansenkonzentrationen von Gesamt-VFA, L-Laktat, NH3 und Redoxpotential beobachtet (Tabelle 6). Im Zusammenhang mit der niedrigeren VFA-Konzentration wurde auch ein Anstieg des pH-Werts im Pansen mit steigenden Iodoform-Dosen beobachtet. Die Zusammensetzung von VFA wurde auch durch eine Erhöhung der Jodoformdosis beeinflusst, wobei eine lineare Abnahme des Acetatanteils und ein Anstieg von Butyrat, Isobutyrat und Isovalerat beobachtet wurden.

Die Amplikonsequenzierung der mikrobiellen Pansengemeinschaft, die auf die V3–V4-Region des 16S-rRNA-Gens abzielt, ergab eine mittlere Lesezahl von 43.221 (ohne Negativkontrollen) zusammengeführten und entrauschten Sequenzlesevorgängen, die zwischen 36.465 und 50.094 Lesevorgängen pro Probe liegt. Die negativen Kontrollproben enthielten nur 10 bzw. 13 zusammengeführte und entrauschte Sequenzablesungen, was die Gültigkeit des Sequenzierungsverfahrens bestätigte. Vor der Filtration wurden insgesamt 5870 ASVs im Bereich von 1131 bis 1438 ASVs pro Probe (Mittelwert: 1232) abgeleitet, von denen 2742 ASVs die Filtrationsverfahren bestanden (pro Probe Bereich 950 bis 1248; Mittelwert 1081). Die Verdünnungskurven pendelten sich bei etwa 20.000 Messwerten ein, was darauf hindeutet, dass die Probenverdünnung bei 35.200 Messwerten zur Erfassung ausreichte. Die Community-Vielfalt (nicht gezeigt). Die Identität der zehn am häufigsten vorkommenden Familien in allen Proben wird in einer nach Behandlung gruppierten Wärmekarte angezeigt (Abb. S1-Ergänzung).

Alpha-Diversitätsmetriken, die anhand des mikrobiellen Reichtums (beobachteter Reichtum: P = 0,73), des mikrobiellen Reichtums und der Gleichmäßigkeit (Shannons Diversitätsindex: P = 0,81) oder der phylogenetischen Abstände zwischen erkannten Mikrobiota (Faiths phylogenetischer Diversitätsindex: P = 0,61) geschätzt wurden, unterschieden sich nicht zwischen den Behandlungsgruppen ergaben, dass Jodoform, unabhängig von der Dosis, keinen Einfluss auf die Alpha-Diversität der Pansenmikrobiota hatte (Abb. 3). Darüber hinaus ergab die Beta-Diversitätsanalyse keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen hinsichtlich der Streuung (Homogenität der Varianz) um Behandlungsschwerpunkte (F = 3,62; P = 0,06). Der Vergleich zwischen den Gruppen zeigte jedoch, dass die Behandlung mit Jodoform einen signifikanten Einfluss auf die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft hatte (F = 2,15, P = 0,02), wobei die Behandlung mit Jodoform 37 % der Gesamtvarianz erklärte. Unterschiede in der mikrobiellen Zusammensetzung werden durch ein PCoA-Ordinationsdiagramm (Abb. 4) visualisiert, das auf Bray-Curtis-Abständen basiert, wobei PCo1 und PCo2 42,3 % bzw. 10,4 % der Gesamtvarianz erklären.

Alpha-Diversitätsschätzungen für beobachtete, Shannons und Faiths phylogene Alpha-Diversitätsmetriken mit Proben, die nach Iodoform-Behandlung gruppiert sind. Alpha-Diversitäten wurden für prävalenzgefilterte, bereinigte und verdünnte ASV-Zahlen geschätzt. Behandlungsunterschiede wurden mithilfe eines Kruskal-Wallis-Rangsummentests geschätzt. P-Werte ≤ 0,05 gelten als signifikant.

Hauptkoordinaten-(PCo)-Ordinationsdiagramm basierend auf Bray-Curtis-Abständen, die den Effekt der Iodoform-Behandlung auf die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft im Pansen auf PCo 1 und PCo 2 darstellen. Bray-Curtis-Abstände wurden für prävalenzgefilterte, beschnittene und verdünnte ASV-Zahlen geschätzt und basierend auf der Iodoform-Behandlung gefärbt Gruppe: 0 mg/Tag, 320 mg/Tag, 640 mg/Tag, 800 mg/Tag. Die durch jeden PCo erklärte Gesamtvarianz wird in Klammern in den Achsenbeschriftungen angegeben. Die Gesamtunterschiede in den Schwerpunkten der Behandlungsgruppen (Gruppenmittelwerte der Bray-Curtis-Abstände) wurden von PERMANOVA geschätzt. P-Werte ≤ 0,05 gelten als signifikant.

Insgesamt wurden 19 Gattungen im Vergleich zur Gruppe, die kein Iodoform erhielt, als unterschiedlich häufig identifiziert (Abb. 5, Tabelle S3). Die Gattung Ruminobacter zeigte den größten Anstieg der Häufigkeit (log2-fache Änderungen für: 320 vs. 0 = 8,7; 640 vs. 0 = 9,1; 800 vs. 0 = 8,3) und war in allen drei mit Iodoform behandelten Gruppen erhöht. Darüber hinaus zeigten neun Gattungen vergleichbare Häufigkeitsmuster sowohl in der 640-mg- als auch in der 800-mg-Dosisgruppe (bei sieben Gattungen nahm die Häufigkeit zu, bei zwei verringerte sich die Häufigkeit). Die verbleibenden neun als unterschiedlich häufig vorkommenden Gattungen waren dosisspezifisch (Abb. 5). Der stärkste Rückgang der Häufigkeit wurde bei der Gattung Erysipelotrichaceae_UCG-002 festgestellt (log2-fache Änderung für 640 vs. 0 = − 6,7), aber Veränderungen in der Häufigkeit von Erysipelotrichaceae_UCG-002 beschränkten sich auf Kühe, die 640 mg Jodoform/Tag erhielten.

Unterschiedlich häufig vorkommende Gattungen wurden für die folgenden Iodoform-Behandlungsvergleiche identifiziert: 320 mg/Tag vs. 0 mg/Tag; 640 mg/Tag vs. 0 mg/Tag, 800 mg/Tag vs. 0 mg/Tag. Für prävalenzgefilterte und bereinigte ASV-Zahlen, die in mindestens 10 % der Proben vorhanden waren, wurde eine differenzielle Häufigkeitsanalyse durchgeführt und auf Gattungsebene reduziert. Angewandte Farbcodes stellen die Zuordnung der Auftragsebene dar. Negative log2-fache Änderungen beziehen sich auf eine Verringerung der Häufigkeit in der mit Iodoform behandelten Gruppe, wohingegen sich positive Änderungen in der Häufigkeit auf eine Zunahme der Häufigkeit in der mit Iodoform behandelten Gruppe beziehen. Mehrfarbige Balken stellen Gattungen mit identischem Gattungsnamen dar, die zu unterschiedlichen Ordnungen gehören. Dies ist nur bei unkultivierten Gattungen der Fall. Statistische Berichte finden Sie in Tabelle S3.

Die durch qPCR bestimmte Gesamtzahl der Methanogene, Methanobrevibacter und Methanosphaera (log10 Kopien/g Pansengehalt), nahm linear mit zunehmender Iodoform-Dosis ab (Tabelle 7). Die Gesamtzahl der Methanogenkopien sank von log10 8,62 auf log10 7,68 mit der 800-mg-Dosis, die Methanobrevibacter-Kopien sanken von log10 8,2 auf log10 6,58 und Methanosphaera sanken von log10 9,06 auf log10 6,88 mit der 800-mg-Dosis. Die Methanomassiliicoccales zeigten eine Tendenz zu einer linearen Reaktion, wurden jedoch durch Iodoform-Behandlungen nicht signifikant beeinflusst und zeigten bei der höchsten Iodoform-Dosis einen leichten numerischen Rückgang von log10 7,3 auf log10 6,88. Die Gesamtzahl der Bakterienkopien (log10 Kopien/g Panseninhalt) wurde durch Jodoformdosen nicht beeinflusst.

In der vorliegenden Studie war die Anpassungszeit relativ kurz (7 Tage). Abbildung S2-Ergänzung zeigt die mikrobielle Zusammensetzung der Kühe, basierend auf Bray-Curtis-Abständen. Die Proben, die von der Kuh stammen, die im ersten Zeitraum 1080 mg/Tag erhalten hat, werden durch sternförmige Symbole dargestellt. Der rote Stern in Abb. S2 zeigt 1080 mg/Tag an, während der braune und der hellbraune Stern Proben derselben Kuh im folgenden Zeitraum bzw. im dritten und vierten Zeitraum darstellen, in denen kein Jodoform zugesetzt wurde. Aus der Abbildung kann für die Kuh, die in der ersten Periode die höchste Dosis (1080 mg/Tag) erhielt, beobachtet werden, dass die mikrobielle Zusammensetzung in der folgenden Periode der mikrobiellen Zusammensetzung in der dritten und vierten Periode (0 mg Iodoform/Tag) ähnelte. Dies deutet darauf hin, dass es nach einer Behandlungspause stabil war.

Die Serumspiegel von NEFA, Gesamtbilirubin und Harnstoff stiegen linear mit zunehmender Jodoformdosis an, wohingegen die Konzentrationen von T4 im Plasma abnahmen (Tabelle 8). Die Werte für alle Biomarker für die Lebergesundheit lagen im normalen Referenzbereich, mit Ausnahme von g-GT und GLDH, wo alle Behandlungen außer 800 mg/Tag Werte über dem oberen Referenzwert aufwiesen. Der Kreatininspiegel im Urin stieg linear mit zunehmender Jodoformdosis an.

Iodoform ist ein wirksamer CH4-Inhibitor, da eine Erhöhung der Dosis stark abnehmende Auswirkungen sowohl auf die tägliche CH4-Produktion als auch auf die CH4-Ausbeute und die CH4-Intensität hatte. Ähnliche Ergebnisse wurden aus Studien berichtet, in denen die Verwendung anderer Halomethanverbindungen als antimethanogene Futtermittelzusatzstoffe bei Wiederkäuern untersucht wurde6,16,20. Die Verringerung der CH4-Emission ging mit einer log10-fachen Verringerung der gesamten Methanogene und einer 1,6 log10-fachen Verringerung der spezifischen Methanogengattungen Methanobrevibacter und Methanosphaera einher. Schnelle Veränderungen der täglichen CH4-Emission rund um die Iodoform-Dosierung könnten jedoch darauf hindeuten, dass Iodoform in erster Linie die Stoffwechselaktivität von Methanogenen unterdrückt, indem es einen für deren Energiestoffwechsel wichtigen Weg hemmt. Darüber hinaus ergab eine Metaanalyse von Newbold et al.55, dass die Häufigkeit von Archaeen trotz ihrer primären Rolle bei der Methanogenese nur eine schwache Korrelation mit den CH4-Emissionen einzelner Tiere aufwies. Da dies die erste veröffentlichte Studie ist, in der Jodoform als Ergänzung zu Milchkühen getestet wird, haben die Autoren keine Beweise dafür, dass die Wirkung von Jodoform einen stationären Zustand erreicht hat. Allerdings wurde der DMI in der letzten Woche jeder Periode und die Futteraufnahme während der gesamten Periode aufgezeichnet, und diese Parameter schienen sich stabilisiert zu haben. Darüber hinaus fanden Machado et al.56 heraus, dass sich das Fermentationsmuster im Pansen und die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft im Durchschnitt innerhalb von 7–8 Tagen stabilisierten. Dies stimmt mit den Ergebnissen aus Abb. S2 ergänzend überein, da sich die mikrobielle Zusammensetzung der Kuh, die im ersten Zeitraum die höchste Iodoform-Dosis (1080 mg/Tag; Daten aus dem Datensatz ausgeschlossen) erhalten hatte, im folgenden Zeitraum offenbar erholt hatte und stabil blieb in den verbleibenden Zeiträumen, was darauf hindeutet, dass die Anpassungsphase von 7 Tagen lang genug war.

Während die Anzahl der Methanobrevibacter und Methanosphaera, die beide dominierende Mitglieder der Pansen-Archaeen-Gemeinschaft sind57, mit steigenden Iodoform-Dosen abnahm, war die Anzahl der Methanomassiliicoccales-Ordnung, früher Pansen-Cluster C (RCC) genannt, interessanterweise weniger von der Behandlung betroffen. Die Methanomassiliicoccales zeigten lediglich eine Tendenz, linear mit zunehmender Iodoform-Dosis, gemessen durch qPCR, abzunehmen. Allerdings kam es bei der Gattung Ca._Methanomethylophilus, einem Mitglied der Ordnung Methanomassiliicoccales, bei der Iodoform-Behandlung mit 800 mg/Tag im Vergleich zur Kontrolle in den Amplikonsequenzen zu einem 2,7-fachen Rückgang. Die dramatische Reduzierung der Kopien, die bei Methanobrevibacter und Methanosphaera mit qPCR, jedoch nicht bei den Amplikonsequenzen beobachtet wurde, kann durch Unterschiede bei den verwendeten Primern erklärt werden, wobei universelle prokaryotische Primer, die für die Amplikonsequenzierung entwickelt wurden, möglicherweise nur eine begrenzte Abdeckung von Archaeen aufweisen58. In einer Studie von Knight et al.20 schien die Zahl der Methanomassiliicoccales sogar zuzunehmen, wenn Kühen Chloroform verabreicht wurde. Diese Veränderungen in Methanogengemeinschaften können auf mehrere Faktoren zurückgeführt werden. Es wurde vermutet, dass Halomethan die Funktion von Corrinoid-Enzymen und den Cobamid-abhängigen Methylgruppentransfer im Methanogeneseprozess hemmt12,13. Somit können sie die Aktivität der Methyl-Coenzym-M-Reduktase kompetitiv hemmen59. Während einige Methanogene in der Lage sind, einen für diesen Prozess benötigten Archaeen-spezifischen Co-Faktor, nämlich Coenzym M (CoM), zu synthetisieren, sind andere Methanogene wie Methanobrevibacter für die Synthese von CoM auf andere Methanogene angewiesen. Dies könnte erklären, warum Methanobrevibacter offenbar empfindlicher auf die Verwendung von Halomethanen reagiert60.

Die Veränderungen in der Häufigkeit der verschiedenen Methanogen-Gattungen könnten auch durch Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber der allosterischen Hemmung der enzymatischen Aktivität durch Halohexane erklärt werden, abhängig von den artspezifischen Wegen, die zur CH4-Bildung führen. Methanosphaera verwenden nur Methanol und H2 als Substrate, während Methanobrevibacter den hydrotrophen Weg nutzt, bei dem CO2, Formiat und H2 zu CH4 metabolisiert werden. Im Gegensatz dazu führen Methanomassiliicoccales eine methylabhängige hydrotrophe Methanogenese durch, indem sie Methylverbindungen mit H2 als Elektronendonor reduzieren60,61. Ungeachtet dessen machen Methanomassiliicoccales in der Regel etwa 9,5 % der Methanogene im Pansen aus, während die Ordnung Methanobakterien mit Methanobrevibacter und Methanosphaera die zahlenmäßig dominierenden Gattungen sind62, was erklären kann, warum der signifikante Rückgang in den beiden letztgenannten Gattungen mit dem starken Rückgang des Methans einherging.

Ähnlich wie in anderen Studien, in denen antimethanogene Futtermittelzusatzstoffe untersucht wurden7,18,20, stieg die H2-Emission in unserer Studie mit zunehmender Hemmung der Methanogenese dramatisch an. Basierend auf stöchiometrischen Berechnungen wurde jedoch nur ein Teil des theoretischen Überschusses an H2 bei Unterdrückung der CH4-Bildung als emittiertes H2 zurückgewonnen. Kühe, denen 0 mg/Tag Jodoform zugesetzt wurden, ergaben 1170 mmol CH4/kg DMI und 9,61 mmol H2/kg DMI, während Kühe, die mit 800 mg/Tag gefüttert wurden, 395 mmol CH4/kg DMI und 1209 mmol H2/kg DMI emittierten. Die Herstellung von 1 Mol CH4 verbraucht 4 Mol H263, und daher hätte eine Verringerung der CH4-Ausbeute um 776 mmol/kg DMI zu einem theoretischen Anstieg der H2-Emission von etwa 3100 mmol/kg DMI führen müssen. Somit stieg in unserer Studie die H2-Ausbeute nur um etwa 40 % des theoretisch erzeugten H2-Überschusses im Pansen. Dies impliziert, dass ein erheblicher Anteil des H2 in andere H2-verbrauchende biologische Prozesse im Pansen umgeleitet worden sein muss und/oder dass eine Veränderung der Mikrobiota hin zu einer geringeren Netto-H2-Produktion stattgefunden hat.

Da die Propionatsynthese einen alternativen Weg zur Nutzung von überschüssigem H2 bietet, wenn die Methanogenese gehemmt ist4, hatten wir erwartet, einen höheren Anteil von Propionat am gesamten VFA in der Pansenflüssigkeit auf Kosten von Acetat zu finden. Es wurde jedoch kein Einfluss auf den Propionatanteil am gesamten VFA beobachtet. Die Bildung von Valerat kann auch als H2-Senke im Pansen fungieren64,65 und daher könnte ein Teil des überschüssigen H2 in Valerat eingebaut worden sein. Daher könnte die Tendenz zu einem linearen Anstieg des Valeratanteils mit zunehmender Jodoformdosis darauf hindeuten, dass andere hydrotrophe Signalwege aktiviert wurden, als den Kühen Jodoform verabreicht wurde.

Interessanterweise beobachteten wir auch eine Zunahme der Häufigkeit der Gattung Ruminobacter in der Familie Succinivibrionaceae im Pansen, wenn Jodoform ergänzt wurde. Erhöhte Häufigkeiten einer zweiten Gattung bei Succinivibrionaceae (Succinivibrionaceae_UCG-002) wurden ebenfalls festgestellt, wenn 640 und 800 mg/Tag Iodoform ergänzt wurden. Mitglieder der Familie Succinivibrionaceae werden mit einer hohen Futtereffizienz bei Milchkühen in Verbindung gebracht66. Darüber hinaus berichteten Danielsson et al.67, dass die Häufigkeit nicht klassifizierter Succinivibrionaceae im Pansen mit reduzierten CH4-Emissionen korreliert, und McCabe et al.68 zeigten, dass eine erhöhte Häufigkeit von Methanogenen negativ mit der Häufigkeit von Succinivibrionaceae bei Bullen korreliert. Darüber hinaus spekulierten Pope et al.69, dass eine Erklärung dafür, warum Wallabys nur ein Fünftel der Menge an CH4 produzieren als Wiederkäuer mit einer faserhaltigen, pflanzlichen Ernährung, auf eine höhere Häufigkeit von Succinivibrionaceae zurückzuführen sein könnte. Mitglieder der Familie Succinivibrionaceae nutzen H2 zur Produktion von Succinat70. Die erhöhte Häufigkeit von Succinivibrionaceae-Gattungen, wenn Kühe mit Iodoform ergänzt wurden, legt daher nahe, dass die Hochregulierung und das Wachstum dieser Bakterien auch zu einem alternativen H2-Senkweg wurden.

Ein Überschuss an Elektronendonoren durch die H2-Akkumulation kann die Pansenfermentation und die mikrobielle Synthese unterdrücken und dadurch indirekt den DMI beeinflussen4,71. Es wurde auch angenommen, dass mikrobiell produziertes H2 für die reduzierenden Bedingungen in der Pansenumgebung verantwortlich ist72. Dementsprechend waren steigende Iodoform-Dosen mit einer deutlichen linearen Verringerung des Redoxpotentials sowie einem erhöhten Pansen-pH-Wert verbunden, was auf Veränderungen der mikrobiellen Aktivität im Pansen und der Fermentationsdynamik hinweisen könnte73.

Iodoform schien die Bakterien nicht abzutöten, da der gesamte mikrobielle Artenreichtum und die qPCR-Anzahl der Bakterien durch die Behandlung nicht beeinträchtigt wurden, aber die Analyse der Beta-Diversität zeigte eine Veränderung der Zusammensetzung des Mikrobioms mit einer klaren Trennung der 0 mg/Tag-Gruppe von die 640- und 800-mg/Tag-Gruppe, während die 320-mg/Tag-Gruppe dazwischen lag. Es könnte spekuliert werden, dass sich die Mikrobiota in Richtung einer geringeren Netto-H2-Produktion verändert hat.

Eine Veränderung der Mikrobenpopulation im Pansen kann auch zur Erklärung der beobachteten Senkung des DMI und der signifikanten oder tendenziell linearen Abnahme der Pansenverdaulichkeit aller Nährstoffe außer NDF mit zunehmender Jodoformdosis beitragen. Die Literatur zur Funktion von Tuzzerella¸, die zur Familie der Lachnospiraceae gehört, ist begrenzt. Viele Mitglieder der Familie Lachnospiraceae weisen jedoch eine zellulolytische Aktivität auf und stehen im Zusammenhang mit der Butyratproduktion74. Die höhere Häufigkeit von Tuzzerella bei den beiden höchsten Dosen im Vergleich zu 0 mg/Tag könnte erklären, warum NDF der einzige Nährstoff war, der mit zunehmender Jodoform-Dosis keine lineare Abnahme der Pansenverdaulichkeit aufwies. Steigende Anteile von Isobutyrat und Isovalerat am gesamten VFA mit zunehmender Jodoformdosis könnten ein Wachstum dieser Größenordnung erleichtert haben, da Isosäuren für das Wachstum und die Aktivität insbesondere zellulolytischer Pansenbakterien wichtig sind75. Eine höhere Häufigkeit von Tuzzerella könnte auch den erhöhten Anteil an Butyrat in der Pansenflüssigkeit mit zunehmender Jodoformdosis erklären.

Die Pansenverdaulichkeit von CP war bei allen Behandlungen negativ, jedoch in einem höheren Ausmaß mit zunehmender Jodoformdosis. Eine erhöhte Rezirkulation von Harnstoff-N in den Pansen mit zunehmender Iodoform-Dosis könnte eine solche Veränderung erklären. Bei Wiederkäuern kann Harnstoff-N über den Speichel oder durch die Pansenwand in den Pansen zurückgeführt werden. Diese Rezirkulation kann zu einer wichtigen Stickstoffquelle für das mikrobielle Wachstum werden, wenn die Menge an im Pansen abbaubarem Protein und damit die Konzentration des N-Substrats NH3 unzureichend ist76. Die Konzentration von NH3 im Pansen wird durch die relative Rate der NH3-Bildung durch den Abbau von Futterprotein oder Harnstoff im Speichel im Verhältnis zur Nutzungsrate für die bakterielle Proteinsynthese, Aufnahme durch die Pansenwand und Auswaschung aus dem Pansen bestimmt Pansen77. In unserer Studie beobachteten wir eine lineare Abnahme der NH3-Konzentration mit zunehmender Jodoformdosis. Dies könnte auf eine effizientere mikrobielle Proteinsynthese hinweisen, da mehr NH3 in mikrobielles Protein umgewandelt wird, und somit die beobachteten Auswirkungen auf die CP-Verdaulichkeit im Pansen mit zunehmender Jodoformdosis erklären. Umgekehrt ergaben Studien, dass ein für ein gutes Wachstum der Pansenmikroben erforderlicher NH3-Mindestspiegel zwischen 4,7 und 5,0 mg/100 ml liegt, wobei der optimale Wert zwischen 8,5 und 30,0 mg/100 ml liegt78,79. Die NH3-Konzentration in der Pansenflüssigkeit von Kühen, denen 0 bzw. 800 mg Iodoform pro Tag verabreicht wurden, betrug 5,5 bzw. 2,76 mM, entsprechend 9,37 bzw. 4,70 mg/100 ml. Daher lag der NH3-Spiegel im Pansen bei der höchsten Iodoform-Dosis nur etwa unter einem Mindestwert. Folglich könnte die geringere NH3-Konzentration mit steigendem Iodoform andererseits auch auf eine gestörte Pansenmikrobiota hinweisen.

Normalerweise ist zu erwarten, dass eine verringerte Futteraufnahme zu einer geringeren Futterdurchgangsrate aus dem Pansen führt, was zu einer längeren Verweilzeit und damit zu einer effizienteren mikrobiellen Verdauung führt80,81. Daher könnte der niedrigere DMI mit zunehmender Jodoformdosis einen zunehmenden Effekt auf die Pansenverdaulichkeit gehabt haben und auch dazu beitragen, zu erklären, warum die NDF-Verdaulichkeit im Pansen durch die Behandlungen nicht beeinträchtigt wurde.

Im Dünndarm ging eine Erhöhung der Jodoformdosis mit einer höheren Verdaulichkeit aller Nährstoffe mit Ausnahme der Stärke einher, was den Veränderungen der Pansenverdaulichkeit entgegenwirkte. Daher wurde die Gesamtverdaulichkeit aller Nährstoffe im Verdauungstrakt durch die Behandlung nicht beeinträchtigt. Ähnliche Ergebnisse wurden von Knight et al.20 und Mitsumori et al.16 berichtet, die Chloroform und Bromchlormethan als CH4-mindernde Futterzusätze bei Kühen bzw. Ziegen untersuchten.

Mehrere Parameter deuteten darauf hin, dass die Energie- und Proteinbilanz der Kühe aufgrund des verringerten DMI mit zunehmender Jodoformdosis zunehmend negativ wurde. Der beobachtete lineare Anstieg des Fettanteils in der Milch mit steigenden Jodoform-Dosen in Kombination mit einem höheren Anteil an langkettigen Fettsäuren in der Milch weist auf eine erhöhte Mobilisierung von Fett aus dem Fettgewebe hin82. Die beobachteten erhöhten NEFA-Spiegel im Serum weisen auch auf eine erhöhte Fettmobilisierung hin83. Milchfettsäuren mit 18 oder mehr Kohlenstoffatomen werden in der Brustdrüse nicht de novo synthetisiert, und in der vorliegenden Studie stammen sie höchstwahrscheinlich aus der Mobilisierung von Fettsäuren aus dem Fettgewebe, da die Nahrungsaufnahme von Lipiden nicht zunahm84. Darüber hinaus war der Anteil von Fett oder Protein in oxidativen Stoffwechselwegen bei Kühen nach Verabreichung von Jodoform erhöht, was durch einen Abfall des RQ unter 1 bei der höchsten Jodoformdosis angezeigt wurde85.

Abgesehen von der erhöhten Brustaufnahme von langkettigem FA könnte auch eine verringerte De-novo-Synthese von FA in der Brust zu den beobachteten Veränderungen in den FA-Profilen der Milch beigetragen haben. Acetat und in geringerem Maße BHB sind die Hauptvorläufer für die De-novo-FA-Synthese, die in der Brustdrüse zur Produktion kurz- und mittelkettiger FA mit 4–16 Kohlenstoffatomen führt84. Geringere Pansenkonzentrationen und damit eine geringere Acetatresorption sind die wahrscheinlichen Erklärungen für den beobachteten verringerten Anteil von MCFA im Milchfett mit zunehmender Jodoformdosis.

Zusätzlich zu einer negativeren Energiebilanz gab es auch Hinweise darauf, dass die Proteinbilanz von Kühen negativer wurde und bei den höchsten Iodoform-Dosen möglicherweise zu einer Nettomobilisierung von Aminosäuren aus Körperproteinen führte. Um eine geringe Stickstoffaufnahme auszugleichen, können aus peripheren Geweben freigesetzte Aminosäuren in der Leber einer Amidierung oder Transaminierung unterzogen werden, was zum Einbau von N in Harnstoff führt86. Die Tendenz zu einem linearen Anstieg des Harnstoffspiegels im Serum könnte darauf hindeuten, dass dieser mit zunehmender Jodoform-Dosierung in zunehmendem Maße auftrat. Dies würde mit einer erhöhten Rückführung von Harnstoff in den Pansen über den Speichel vereinbar sein, was, wie bereits erläutert, auf die negativere Pansenverdaulichkeit von CP mit zunehmender Jodoformdosis zurückzuführen sein könnte.

Der Abbau von Skelettmuskelgewebe führt zur Freisetzung von Kreatinin, das anschließend mit dem Urin ausgeschieden wird87. Løvendahl und Sehested88 berichteten über Kreatininkonzentrationen im Urin gesunder Kühe mit positiver Energiebilanz, die den in der vorliegenden Studie beobachteten Werten für die beiden niedrigsten Dosen ähnelten, während die Werte für die beiden höchsten Jodoformdosen die erwarteten Urinkonzentrationen von Kühen mit positiver Energiebilanz überstiegen . Der Kreatininspiegel im Urin kann auch durch die Wasseraufnahme beeinflusst werden89, der Prozentsatz der im Urin ausgeschiedenen Gesamtwasseraufnahme wurde jedoch durch die Behandlungen in unserer Studie nicht beeinflusst.

Die täglichen Mengen an zugesetztem Jod überstiegen den in den Vorschriften der US-amerikanischen Food and Drug Administration festgelegten maximalen Gesamtgrenzwert (50 mg I/Tag). Jod ist ein notwendiger Nährstoff bei der Synthese von Schilddrüsenhormonen, und diese Synthese kann als Indikator für die Schilddrüsenfunktion verwendet werden90. Hohe Jodspiegel können die Synthese von Thyroxin oder T4 aufgrund negativer Rückkopplungsmechanismen in der Hypothalamus-Hypophysen-Schilddrüsenhormon-Achse herunterregulieren91. Unter der Annahme, dass Jodoform sowohl im Pansen als auch in der Leber metabolisiert werden kann, was zur Freisetzung von ionisiertem Jod führt, könnte eine erhöhte Jodaufnahme die lineare Verringerung des Plasma-T4 mit zunehmender Jodoform-Dosis erklären. Die Werte blieben jedoch für gesunde Rinder im normalen Bereich (54–110 nmol/L)92. Daher schien die Schilddrüsenfunktion bei keiner Dosis, die den Kühen im Experiment verabreicht wurde, durch Jodoform beeinträchtigt zu werden. Der T4-Plasmaspiegel bei Rindern wird auch durch eine Reihe anderer Faktoren beeinflusst, einschließlich der Futteraufnahme93. Somit könnte die deutliche Senkung des DMI auch dazu beigetragen haben, die Abnahme der T4-Konzentration mit steigenden Jodoform-Dosen zu erklären.

Es wurde festgestellt, dass zahlreiche Halomethan-Analoga bei verschiedenen Tierarten Leberschäden in Form beschädigter oder nekrotischer Hepatozyten verursachen94,95,96. Eine Beurteilung der Leberfunktion sollte auf der Beurteilung mehrerer Leberenzyme und Indikatoren für eine Leberschädigung oder -erkrankung basieren97. Gamma-Glutamyltransferase (g-GT) wird häufig in Kombination mit anderen Leberenzymen als Indikator für Leberfunktionsstörungen verwendet97. Es wurde kein Behandlungseffekt auf den g-GT-Spiegel festgestellt, aber alle Behandlungsgruppen mit Ausnahme von 800 mg/Tag wiesen g-GT-Spiegel auf, die leicht über dem vom kommerziellen Labor angegebenen normalen Referenzbereich lagen. Ebenso lag der GLDH-Wert bei allen Behandlungsgruppen mit Ausnahme von 800 mg/Tag über dem Referenzbereich des kommerziellen Labors. Dennoch lagen die Werte beider Enzyme für alle Behandlungsgruppen innerhalb des Bereichs, der in anderen Studien für klinisch gesunde Holstein-Kühe angegeben wurde98,99. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen in der vorliegenden Studie beobachteten Lanigan et al.100 keine signifikanten Anzeichen einer Leberfunktionsstörung, wenn Schafen ähnliche Mengen Jodoform pro kg Lebendgewicht verabreicht wurden. Allerdings ist zu beachten, dass in der vorliegenden Studie nur die kurzfristige Einnahme von Jodoform untersucht wurde.

Iodoform hatte eine dramatische und dosisabhängige unterdrückende Wirkung auf die tägliche CH4-Emission, den Ertrag und die Intensität von Milchkühen, was höchstwahrscheinlich durch eine Depression der Stoffwechselaktivität der Methanogene verursacht wurde. Der theoretische Überschuss an H2, der sich aus der Reduzierung der CH4-Synthese ergibt, wurde nur teilweise als emittierter H2 zurückgewonnen, da alternative Wasserstoffsenkenwege durch die Hochregulierung hydrotropher Bakterien und/oder eine Änderung der Mikrobiota hin zu einer geringeren Netto-H2-Produktion aktiviert wurden. Bei allen Nährstoffen, mit Ausnahme von NDF, war die Pansenverdaulichkeit beeinträchtigt, und die deutlichen Senkungen des DMI könnten auf die Ansammlung von H2 im Pansenkopfraum oder auf unerwünschte Auswirkungen von Jodoform auf die mikrobielle Fermentation zurückgeführt werden, obwohl die Gesamtzahl der Pansenbakterien durch die Behandlung nicht beeinflusst wurde. Aufgrund einer erheblichen Verschiebung von der Pansenverdaulichkeit zur Dünndarmverdaulichkeit wurde die Gesamtverdaulichkeit aller Nährstoffe durch Jodoform nicht beeinträchtigt. Die ergänzten Jodoform-Dosen schienen für die Dauer des Experiments keine negativen Auswirkungen auf die Schilddrüsen- oder Leberfunktion der Kühe zu haben, es gab jedoch mehrere Hinweise auf eine negativere Energie- und Proteinbilanz mit zunehmender Jodoform-Dosis, die zur Erklärung beitrugen warum die Milchproduktion durch Jodoform weniger negativ beeinflusst wurde als durch DMI.

Die Daten wurden im Hauptmanuskript und in ergänzenden Materialien dargestellt. Rohe Mikrobiomsequenz-Lesevorgänge werden in der NCBI-Short-Read-Archivdatenbank unter der BioProject-ID: PRJNA906944 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA906944) abgelegt.

Saure Waschmittelfaser

Saures Reinigungsmittel Lignin

Aspartataminotransferase

β-OH-Butyrat

Kohlenstoff

Kohlendioxid

Coenzym M

Rohprotein

Aufnahme von Trockenmasse

Fettsäuren

Gamma-Glutamyltransferase

Glutamat-Dehydrogenase

Wasserstoff

Langkettige Fettsäuren

Mittelkettige Fettsäuren

Methan

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Nicht veresterte Fettsäuren

Teilweise gemischte Ration

Atmungskoeffizient

Thyroxin

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Die Autoren danken dem Stallpersonal, insbesondere Tanja Skovbo, Michael Christensen und Jørgen Nielsen, für die fachmännische Betreuung der Tiere während des Experiments und den Labortechnikern für die kompetente Durchführung der Laboranalysen (AU Viborg – Forschungszentrum Foulum, Tjele, Dänemark). ). Ein herzlicher Dank geht auch an Torkild Jakobsen und Ester Bjerregaard für ihre Unterstützung bei der Versuchsplanung und den Probenahmen.

Das Experiment wurde vom Innovation Fund Denmark (Grant-ID: 0244-00011B), Vilofoss A/S, Dänemark, und DLG amba, Dänemark, finanziert. Darüber hinaus dankt M. Thorsteinsson für die Unterstützung eines Doktorandenstipendiums, das von der Graduate School of Technical Sciences (Universität Aarhus, Dänemark), dem Innovation Fund – Dänemark (Grant-ID: 9067-00024B) und Arla (Stipendium: Professur – Nachhaltige Milchwirtschaft) finanziert wird Produktion).

Abteilung für Tier- und Veterinärwissenschaften, AU Viborg – Forschungszentrum Foulum, Universität Aarhus, 8830, Tjele, Dänemark

Mirka Thorsteinsson, Peter Lund, Martin Riis Weisbjerg, Samantha Joan Noel, Anna Amanda Schönherz, Anne Louise Frydendahl Hellwing und Mette Olaf Nielsen

iCLIMATE – Interdisziplinäres Zentrum für Klimawandel, Universität Aarhus, 8830, Tjele, Dänemark

Mirka Thorsteinsson, Peter Lund, Martin Riis Weisbjerg, Samantha Joan Noel, Anna Amanda Schönherz, Anne Louise Frydendahl Hellwing und Mette Olaf Nielsen

CBIO – Zentrum für zirkuläre Bioökonomie, Universität Aarhus, 8830, Tjele, Dänemark

Mirka Thorsteinsson, Peter Lund, Martin Riis Weisbjerg, Samantha Joan Noel, Anna Amanda Schönherz, Anne Louise Frydendahl Hellwing und Mette Olaf Nielsen

Abteilung für Veterinär- und Tierwissenschaften, Universität Kopenhagen, 1870, Frederiksberg, Dänemark

Hanne Helene Hansen

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MT, PL, MRW, ALHF, SJN, AAS, HHH und MON haben die Studie entworfen. MT, MON, SJN und ALHF führten das Experiment durch. MT, AAS, ALFH und SJN analysierten die Daten. MT, PL, MRW, ALHF, SJN, AAS, HHH und MON interpretierten die Daten. MT schrieb das erste Manuskript. Alle Autoren haben das Manuskript überarbeitet und die endgültige Fassung genehmigt.

Korrespondenz mit Mirka Thorsteinsson.

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen; Allerdings sind MO Nielsen und HH Hansen in der Patentanmeldung als Miterfinder aufgeführt.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Thorsteinsson, M., Lund, P., Weisbjerg, MR et al. Enterische Methanemission von Milchkühen, denen Jodoform in einer Dosis-Wirkungs-Studie verabreicht wurde. Sci Rep 13, 12797 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38149-y

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Eingegangen: 09. Januar 2023

Angenommen: 04. Juli 2023

Veröffentlicht: 07. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38149-y

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